[发明专利]一种活细胞线粒体数量染色检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞生物学染色方法，特别涉及一种新的活细胞线粒体数量染色检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

线粒体（Mitochondrion）是细胞中制造能量的细胞器，被称为细胞的“power house（发电厂）”。除了为细胞供给能量外，线粒体还参与诸如细胞分化、遗传体系、信息传递和细胞凋亡等过程。

细胞内含有线粒体的数目可以从几百个到数千个不等，与细胞生理功能及生理状态有关。线粒体对各种内外损伤较为敏感，在细胞损伤时线粒体数量的变化是最常见的改变之一。例如生理状态下皮肤细胞的新陈代谢离不开正常发挥功能的线粒体；在病理状态下线粒体数量的增多是对慢性细胞损伤的适应性反应等。

目前检测线粒体数量采用的共聚焦显微镜、流式细胞仪分析、铁苏木精染色和健那绿染色等方法存在一定的不足。共聚焦显微镜检测线粒体需要先准备良好的样品，然后在通过显示单个细胞内部精确的三维图像，通过对三维图像技术观察得到线粒体数量的结果，这使得共聚焦显微镜检测分析的操作机器繁琐，消耗很长的时间才能完成一个样品的检测，而且样品检测观察的数量较少，容易出现局部偏差，影响线粒体数量统计。流式细胞仪分析检测分析的是悬浮在液体中的分散细胞的一系列属性，对于细胞内部的线粒体数量分析缺乏细节分辨率，因而准确度较差。

铁苏木素染色，是一种实验室染色技术，主要用于各种阿米巴和蓝氏贾第鞭毛虫滋养体和包囊的鉴定，对于细胞内部的线粒体缺乏针对性，导致染色的显示分辨率较低，不利于精确的计数统计。

健那绿染色，即Janus green B 染液，是专一性线粒体的活细胞染料，线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色，而细胞质接近无色，以在高倍显微镜下观察线粒体分布和形态。健那绿染料毒性较强，且试剂的价格较高。

所以，现有的染色方法存在诸如：操作繁琐、仪器设备昂贵、检测灵敏度、精确度不足等缺陷。现有的研究需要对于不同的情况，需要染色观察的目标、待区分对象都可能随着环境变化而变化，依然需要更多的不同的染色方法对现有的细胞线粒体提供更多的研究方法，为不同的研究目的提供研究基础。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中线粒体数量检测方法所存在的操作繁琐、检测速度慢、结果准确度较低等的上述不足，提供一种新的线粒体染色检测方法。该新型技术具有简单快速、灵敏、经济的线粒体染色的技术方法，以与传统检测方法相互补充、提高检测准确度。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种活细胞线粒体数量染色检测方法，包括以下步骤：

（1）原液配制：噻唑蓝（MTT）溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS，pH=7.4）中，配制成浓度为0.3-1wt%的溶液，过滤以除去细菌，避光保存。

（2）接种细胞：用培养液配成单个细胞悬液，以每孔约2000-10000个细胞接种到96孔板中，每孔体积200-300μL。可以选用其中型号的孔板，例如6、12、24、48孔板等，选用96孔板能够培养更多的观察样本。

（3）培养细胞：根据细胞类型设置培养条件，培养2-8天，优选3-5天。培养3-5天以后，培养基中细胞融合率60-80%，细胞的整体融合比例适宜，进行染色观察的时候更容易观察线粒体的整体数量以及变化情况。

（4）染色：每孔加入上述噻唑蓝MTT原液20-30μL，细胞培养箱内继续孵育3-5h，优选3.5-4.5 h。适宜的孵育时间使得细胞能够更加充分吸入MTT，并使之聚集在线粒体内部或周围，使得后续染色观察的结果准确可靠。孵育时间过长，细胞出现衰亡，线粒体观察计数结果失去准确性，对于研究的指导意义降低。

（5）观察：小心吸取孔内培养上清液10-50μL，加入200-300μL新鲜的培养液，并于高倍光学显微镜下观察蓝紫色颗粒数量。

本发明的活细胞线粒体数量染色检测方法，利用MTT染色处理活细胞，首先将细胞培养至融合率为60-80%的适宜比例范围内，然后通过MTT染色显示出蓝紫色的显著颜色。因为MTT对于活细胞的线粒体具有显著的针对性，显色结果非常明显，同时适当比例融合的细胞个体可以方便光学显微镜下观察统计数量。