[发明专利]一种利用宏基因组测序辅助筛选烟草发酵过程中微生物的方法

说明书

本发明公开了一种利用宏基因组测序辅助筛选烟草发酵过程中微生物的方法，属于烟草发酵过程中优势微生物的筛选技术领域。本发明所提供的方法为首先采集烟叶样品，然后在对烟叶样品进行高通量测序分析其菌群结构的同时采用普通方法分离样品中的好氧微生物，之后根据高通量测序结构中群落组成与结构特点，采取特定的筛选培养基及筛选方法，对其余菌属微生物进行分离，反复多次后，采用划线纯化的方法得单一菌落。通过这种方法在避免盲目性，提高筛菌效率的同时也分离得到到发酵烟叶中的大多优势微生物，为微生物协助醇化提供研究基础。

技术领域

本发明涉及一种利用宏基因组测序辅助筛选烟草发酵过程中微生物的方法，属于烟草发酵过程中优势微生物的筛选技术领域。

背景技术

烟叶醇化是卷烟生产加工过程中影响和改善烟叶品质的一个重要环节，即烟叶通过烘烤(或晾晒)和复烤后，在自然条件下使烟叶内含物发生一系列化学和生物化学变化的一个过程。其目的在于去掉烟叶的青杂味和改善烟叶香味，吃味等品质，故按要求对烟叶必须进行醇化。烟叶醇化工艺分为传统的人工醇化和自然醇化，传统的人工醇化虽然速度快，但醇化效果差，目前采用的很少；自然醇化还是采用最多的纯化方法，原因在于自然醇化效果好，但是其不足也随着对效率的追求增大而逐渐暴露，自然醇化的不足现在主要有：一是因烟叶富含营养物质以及长期与外部环境密切接触，烟叶很容易生虫；二是在春夏秋冬四季变化过程中，因为温度、湿度变化大，烟叶很容易产生霉变；三是因烟叶长期与过量空气接触，烟叶颜色很容易变褐、变深，所以自然醇化时间不能过长，一般不能超过3年。这些自然醇化过程中存在的不足不仅给烟厂造成严重的损失，而且还严重影响烟叶的内外在品质，影响烟叶深加工产品的质量。故解决烟叶醇化中这些不足，提高烟叶的品质及降低烟草的生产成本等已成为重点解决的问题。

微生物作用在烟叶醇化过程中不容忽视，微生物参与并制约醇化过程的进行和醇化质量的好坏，相比传统的人工醇化，在微生物协助醇化方面，前期李天丽等人虽获得了部分醇化相关的菌株，但缺乏对发酵微生物菌群结构的全面研究，调控效果较差。而且在醇化菌株的分离时，多采用传统的分离方法，忽略了常规条件下不可培养微生物在烟草醇化中起到的重要作用。故通过高通量测序对自然醇化过程的微生物群落结构进行研究，通过改善培养基及应用特定的方法分离获得自然醇化过程中的关键菌株，从而以自然醇化指导人工醇化，提高人工醇化的质量和效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种烟草发酵过程中微生物的筛选方法，即基于高通量测序技术提供的生物多样性信息制定针对不同菌株特定的筛选方法，并结合不可培养微生物的分离方法，可分离出大多数烟草发酵过程中微生物，具有一定的定向性，节约时间，对指导人工烟叶醇化具有重要的指导意义。

本发明是一种利用宏基因组测序辅助筛选微生物的方法，该方法是首先采集烟叶样品，然后在对烟叶样品进行高通量测序分析其菌群结构的同时采用普通方法分离样品中的好氧微生物，之后根据高通量测序结构中群落组成与结构特点，采取特定的筛选培养基及筛选方法，对其余菌属微生物进行分离，反复多次后，采用划线纯化的方法得单一菌落。通过这种方法在避免盲目性，提高筛菌效率的同时也分离得到到发酵烟叶中的大多优势微生物，为微生物协助醇化提供研究基础。

进一步地，所述方法是按照以下步骤进行的(图1)：

一、从烟叶醇化库中随机抽取烟叶样品；

二、采用高通量测序技术对烟叶样品中微生物群落多样性与丰度进行分析，获得微生物群落的菌群种类、丰度和空间生态分布信息；

三、进行高通量测序的同时，随机抽取步骤一中得到的烟叶样品，在无菌条件下获得烟叶表面菌株的原始菌悬液，原始菌悬液梯度稀释后，分别涂布于分离细菌的普通固体培养基上培养，将培养得到的菌落进行纯化获得单菌落，重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，并对所有分离得到的细菌进行鉴定及保藏；

四、比较步骤二和步骤三的结果，确定步骤三中没有分离出来的微生物种类；