[发明专利]一种叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的定量检测方法

权利要求书

1.一种叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a、SiO₂-FO包被抗原和免疫原的制备；

b、抗SiO₂-FO抗体的制备；所述SiO₂-FO抗体的效价为1:64000；

c、将SiO₂-FO包被抗原经包被液稀释后包被于酶标板中，封闭、加入不同浓度的SiO₂-FO标准品，以抗SiO₂-FO抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体作为二抗，建立间接竞争酶联免疫分析法定量检测SiO₂-FO；

d、以SiO₂-FO标准品浓度的对数为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，从而定量检测出SiO₂-FO的浓度；

所述步骤a具体包括以下步骤：

a-1、称取10~20mg SiO₂-FO溶于1~2mL PBS溶液中，磁力搅拌1~2h即得到水溶性的SiO₂-FO溶液；

a-2、称取10~20mg OVA溶于2~4mL PBS溶液中,并在搅拌下加入步骤a-1得到的SiO₂-FO溶液，混合均匀后再滴加80~200μL 25%戊二醛溶液，25~28℃下避光搅拌2~5h；将反应液置于透析袋中，用PBS透析24h后收集即可得到SiO₂-FO包被抗原，其浓度为2~4mg/mL；

a-3、称取10~20mg BSA溶于2~4mL PBS溶液中，并在搅拌下加入步骤a-1得到的SiO₂-FO溶液，混合均匀后再滴加80~200μL 25%戊二醛溶液，25~28℃下避光搅拌2~5h；将反应液置于透析袋中，用PBS透析24h后收集即可得到SiO₂-FO免疫原，其浓度为2~4mg/mL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的线性方程为A=0.8535-0.1083logC，其中A为490nm处的吸光度值，C为SiO₂-FO浓度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，透析袋的截留分子量为8000~14000Da。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，水溶性的SiO₂-FO溶液浓度为5~15mg/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b具体包括以下步骤：

b-1、首次免疫：将SiO₂-FO免疫原与弗氏完全佐剂等体积比混合后，采用背部皮下多点注射的方式注射到大白兔体内，注射8~10个点，注射量为1~2mL/只；首次免疫三周后进行加强免疫；

b-2、加强免疫：将SiO₂-FO免疫原与弗氏不完全佐剂等体积比混合后，采取同样的方式注射到大白兔体内，注射8~10个点，注射量为1~2mL/只；此后每两周进行再次加强免疫，中间周进行耳静脉采血测血清效价，直到效价达到1:64000，再进行最后一次加强免疫，并在免疫一周后从动物颈动脉采血，静置析出抗血清并进行纯化，得到抗SiO₂-FO抗体，其浓度为5~10mg/mL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c具体包括以下步骤：

c-1、包被：用包被缓冲液将SiO₂-FO包被抗原稀释1000倍，包被96孔酶标板，每孔100µL，4℃冰箱过夜；

c-2、封闭：甩干，PBST溶液洗涤3次，每次3~5min，洗去未被结合上的SiO₂-FO包被抗原，加入1wt%酪蛋白，每孔200μL进行封闭，37℃烘箱温育1~2h；

c-3、加样竞争：甩干，PBST溶液洗涤3次，每次3~5min，洗去多余的封闭液，然后将50µL不同浓度的SiO₂-FO标准品和50µL抗SiO₂-FO抗体分梯度加入各孔中，使之发生竞争反应，37℃烘箱温育2~4h；

c-4、加酶：甩干，PBST溶液洗涤3次，每次3~5min，每孔加入100µL PBS稀释的稀释比为1/5000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，37℃烘箱温育2~4h；

c-5、显色：甩干，PBST溶液洗涤3次，每次3~5min,洗去未被结合的二抗，每孔加入100µL邻苯二胺底物液进行显色反应，37℃烘箱温育0.5~1h；

c-6、终止：每孔加入50µL 2mol/L H₂SO₄终止反应，用多功能酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度值。