[发明专利]一种单管检测非缺失α与β地中海贫血的基因芯片、引物组及试剂盒

说明书

本发明“一种单管检测非缺失α与β地中海贫血的基因芯片、引物组及试剂盒”,属于分子诊断技术，其特征在于基于直接多重PCR和反向点杂交相结合的检测原理，根据各基因型的突变或缺失位点设计相应的扩增引物和探针，以生物素标记引物，以氨基标记探针，并以基因芯片为基底，将探针固定在DNA芯片上，通过特异性引物扩增出来的PCR产物与探针进行杂交，以信号显色盒判读来进行地贫的诊断。

技术领域

本发明涉及α与β地中海贫血的分子诊断技术，特别是涉及一种单管直接PCR(Direct PCR)结合RDB法检测3种非缺失型α地贫点突变和19种β地贫突变位点的基因芯片、引物组及试剂盒。

背景技术

地中海贫血(thalassemia,简称地贫)，是由于α或β珠蛋白基因缺失或突变导致珠蛋白链合成障碍，造成α链与β链的比例失去平衡，相对过剩的链呈游离状态，进而导致血红蛋白不稳定，冗余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上，容易氧化变性，红细胞膜的通透性和脆性发生改变，导致溶血性贫血，临床上常表现出症状轻重不一的慢性进行性溶血性贫血。并且根据受累的珠蛋白肽链的类型分为α、β、γ、δ和δβ地贫等类型。其中以α、β地贫最为常见，危害也最大。广泛发生于热带和亚热带国家，我国长江以南发病率高，无明显症状的携带者超过人群20％。

α-地中海贫血(以下简称α-地贫)，是一组因α-珠蛋白链不能合成或合成减少，使β链与δ链异常结合而导致HbA2减少的疾病。α-珠蛋白基因缺失或点突变均可导致α-地贫，分别称为缺失型或非缺失型α-地贫。在中国，目前已报道至少6种非缺失型α-地贫基因突变，其中WS、QS和CS三种点突变是最常见突变，这些突变均位于α2-珠蛋白基因上。资料表明中国α-地贫发病率最高的广西有45.8-53.3％的Hb H病患者携带非缺失型α地贫基因，这类病人比那些缺失3个α珠蛋白基因所表现出来的临床症状更严重，贫血更严重。α2-珠蛋白基因发生非缺失型突变的纯合子或复合杂合子会引起重度贫血的Hb H症状。

β珠蛋白基因簇位于人体11号染色体的短臂上，总长度约为50Kb，包括。ε、Gr、Ar、δ和β珠蛋白基因及2个假基因。β珠蛋白肤链是由β珠蛋白基因所编码的146个氨基酸组成。β珠蛋白基因含2个内含子及3个外显子。β地中海贫血的主要分子病理学基础是β珠蛋白基因的点突变及小的插入或缺失，包括β珠蛋白基因的启动子序列突变或增强子突变都可引起β珠蛋白生成障碍性贫血。在其外显子1、外显子2、内含子1及3’端调控区集中了中国人群中发现的大部分突变。目前在全世界己报道约170种左右的β珠蛋白基因的突变类型，我国己发现至少有28种此类突变，最主要的有6种CD41-42，CD17，IVS-2nt654,TATAbox-28,CD71-72及CD26占中国人β地中海贫血突变基因总数的90％以上。

β地中海贫血是因调控β珠蛋白的基因缺陷而导致的β珠蛋白合成障碍的一种溶血性贫血。β地中海贫血是最常见的单基因遗传病之一，在我国南方各省区高发，高发区人群基因携带率达到3-9％。β地中海贫血的纯合子或或β⁰β⁺的双重杂合子为致死性疾病，

目前地中海贫血仍无较理想的治疗手段，采用基因分析法进行产前诊断，可在妊娠早期对中、重型地中海贫血患儿做出诊断并及时终止妊娠，以避免中、重型地中海贫血患儿出生是目前预防本病行之有效的方法。

目前对地贫筛查方法如血常规参数检测分析、红细胞渗透脆性试验、血红蛋白电泳试验等特异性不高，较易产生假阴性。对于α-地中海贫血的分子诊断,PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-ASO)是最早用于检测点突变的一种方法，一次只能检测一种突变，对于多个突变位点的检测操作复杂，成本高而不适合常规检测。近年发展起来的单链构象多肤性分析(PCR-SSCP)、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、TaqMan探针荧光PCR法与高分辨熔解曲线检测技术(HRM)等，这些方法首先检测费用昂贵，且操作要求费时或不定性。但这些方法检测过程繁琐、检测所用时间长、使用试剂或者仪器昂贵和特殊的标记引物等，因而不利于临床广泛的推广应用。