[发明专利]马链球菌兽疫亚种SXY36及在发酵生产透明质酸中的应用

说明书

本发明公开了一种马链球菌兽疫亚种SXY36及在发酵生产透明质酸中的应用，本发明提供了马链球菌兽疫亚种SXY36菌株，以及发酵工艺法控制HA分子量的方法，其有益效果主要体现在：(1)SXY36经紫外线、微波和γ射线照射诱变选育，无溶血性，HA发酵产率高，遗传稳定，在优选的发酵条件下，摇瓶发酵产率可达0.731g/L，发酵罐发酵的产率可达4.78g/L；(2)采用两段变温发酵和稳定pH法，可以发酵制备高分子量HA，分子量可达1.89MDa，是常规发酵法的2倍。(3)采用发酵液自酶降解法制备不同分子量HA，控制酶解时间，即可生产分子量在0.035～1.89MDa范围内的HA。

(一)技术领域

本发明涉及一株透明质酸产生菌—马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.zooepidimicus)SXY36菌株，及其在可控分子量透明质酸的发酵法生产中的应用。

(二)背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，简称HA)又被叫做玻尿酸、玻璃酸等，是以D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺，两者之间以β-1,3-糖苷键或β-1,4糖苷键相连组成二糖结构，二糖继续交联便组成了线性、无支链的高分子聚合物，一般研究和应用的HA的平均分子量在0.1-10MDa之间。在适当的pH条件或者生理环境中，HA中糖醛酸的羧基便会与钠离子结合生成盐，因此工业生产中的产品多为透明质酸钠(sodium hyaluronate，简称SH)。因HA具有极佳的保水性，独特的流变性、超高的润滑性等多糖的性质，以及其良好的生物兼容性、无毒副作用和可吸收性等特点，在美容护肤、医药保健，手术医疗等领域均有广泛的应用。

目前HA的生产主要有两种，一是从高等动物的部分组织中分离纯化，二是通过微生物发酵获得。可以用来制备HA的动物组织有眼睛玻璃体、鸡冠、脐带和关节滑液等，其中整体含量最高的是鸡冠，其次是关节滑液，基于材料来源和成本的考虑，生产上主要用眼睛玻璃体和鸡冠。与动物组织提取法相比，微生物发酵法因成本低、不受材料限制、提取分离简单方便、产物纯度高、能规模化生产等优点，逐渐成为生产HA的主流方法，即便如此，围绕提高HA发酵产率，控制分子量的研究仍在继续。

通过发酵获得的HA分子量分为3种：高分子量HA(HMWHA)、低分子量HA(LMWHA)以及HA寡聚糖(o-HA)，其中HMWHA的平均分子量一般大于1MDa，LMWHA为0.01～0.1MDa，o-HA小于0.01MDa。

HMWHA具有较好的保水性、粘弹性、流变性，能够抑制炎性反应、润滑组织关节等，一般应用于眼科手术和化妆品。LMWHA与HMWHA相比，有不同的生物学功能。例如，在刺激软骨细胞和淋巴母细胞分化方面，平均分子量在0.2～0.4MDa范围内的HA刺激作用最强，而平均分子量大于1.0MDa的HA则无刺激作用。HMWHA会抑制炎症反应，而LMWHA可促进。近年来，LMWHA由于有促进血管增生、伤口愈合、诱导免疫因子的表达，抑制肿瘤的增殖和抗菌等作用，被越来越多的用在医药和保健食品方面。

目前，LMWHA的获得主要是通过大分子HA水解制备，主要有物理、化学和生物降解法。物理降解一般采取加热、机械剪切、γ-射线照射、超声波、紫外线等。化学降解可分为水解型和氧化型降解。在氧化降解中，氧自由基攻击中的糖苷键，HA分子发生断裂就会产生小分子量HA。生物降解主要是通过透明质酸酶的作用，一般酶解法的效率最高，产生的平均分子量最小，如中国发明专利“一种添加透明质酸酶提高小分子透明质酸发酵产量的方法”(201410308790.X)向兽疫链球菌的发酵液中添加透明质酸酶，能得到LMWHA和o-HA，但外加透明质酸酶，无疑增加了生产成本。

HA在国内外市场上的需求量非常大，但近年来原材料价格和发酵成本的提高限制了HA的生产，进而限制了其在医药、化妆品和保健食品等方面的应用。因此如何通过微生物发酵法的可控性特点来进一步提高HA的产率，以及根据需求生产不同分子量的HA成为新的研究方向。本发明使用发酵控制手段可以将HA的分子量提高1倍，采用自酶降解法，可以制备不同分子量范围的LMWHA，满足不同领域应用的需求。