[发明专利]一种来源于宏基因组的三苯甲烷类染料脱色酶及编码基因

说明书

本发明涉及生物技术和基因工程领域，本发明提供了一种从活性污泥宏基因组文库中筛选具有脱色酶基因克隆子的方法，并公开了一种三苯甲烷类脱色酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该脱色酶可有效使三苯甲烷类染料色度降低，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术和生物工程领域，具体涉及一种来源于印染废水活性污泥宏基因组的三苯甲烷类染料脱色酶Tmt及其编码基因tmt。

背景技术

大量天然或合成的染料一直被大量用于纺织、印染、造纸、皮革和涂料等行业，三苯甲烷类染料是染料中相当重要的一种，使用极为普遍。由于三苯甲烷类染料大多有致突变、致畸或致癌作用，其色度也会影响水体的透光率进而使植物和微生物的生长受阻，故而引起了广泛的关注。

生物法处理染料废水是一种发展的趋势，因为它费用低，而且环境友好，二次污染小。固定化脱色酶应用于染料废水的脱色时，能避免受到诸如通气情况、营养度、pH值、温度、染料毒性等因素的影响，具有良好的应用潜力，所以生物法处理染料的研究热点正在从脱色菌的筛选转移到脱色酶的筛选、克隆及表达。目前克隆到的脱色酶主要集中在三苯甲烷还原酶（triphenylmethane reductase，TMR）、漆酶（laccase）、偶氮还原酶（azoreductase）和过氧化物酶（peroxidase）等几类功能酶。现在已有将固定化酶用于偶氮染料脱色的相关报道。

在筛选功能酶时，基于传统微生物培养的筛选方法只能从不足环境微生物总量1%的可培养微生物中寻找目标基因，覆盖面太窄。解决方法即是宏基因组技术，该技术绕过了微生物培养环节，为目的基因的筛选提供更加全面和多样的基因资源。

发明内容

本发明的目的是提供一种高活性的三苯甲烷类脱色酶。

本发明从印染厂污水处理系统的活性污泥宏基因组文库中，通过孔雀石绿富集并筛选得到具有脱色酶基因的阳性克隆子并从中找到一个与脱色相关的基因tmt，该基因全长为333 bp（从起始密码子到终止密码子），编码110个氨基酸。通过PCR的方法，将克隆得到脱色酶基因tmt与克隆载体pUC18连接后得到重组质粒pTMT，在大肠杆菌DH5α中即可以表现出良好的脱色能力。克隆该基因重组质粒pTMT的菌株Escherichia coli于2017年6月8日保藏至位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2017318。

本发明的第一个目的是提供一种编码所述的脱色酶基因tmt，所述的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种脱色酶Tmt，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种从宏基因组文库中筛选具有脱色酶基因的克隆子的方法。

本发明还提供一种含有所述的脱色酶基因tmt的重组载体。所述的表达载体，是pUC18。

本发明所述低温碱性酯酶Est18来自印染厂活性污泥宏基因组，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示：

MSAFVYLTMAIVAEVIATTMLKASEGFTRLWPSLLVVLGYGVAFWGLSMVVKSMPLGIVYAIWSGMGIVLVSIAAVFVYQQKLDWPAIVGMGLIIAGVLVINLLSKASVH

附图说明

图1：pTMT阳性克隆脱色示意图。

具体实施方式

实施例1：带有脱色酶基因克隆子的筛选