[发明专利]一种基于果寡糖修饰的抗冻糖肽的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种基于果寡糖修饰的抗冻糖肽的制备方法及应用，属于生物、食品加工技术领域。

背景技术

抗冻蛋白，俗称冰结构蛋白，又叫作热滞蛋白，首先于1969年由 Devries 在南极海峡的一种极地鱼（Trematomus borchgrevinki）的血液中发现。抗冻蛋白具有低温保护活性，可以作为冷冻保护剂应用于医学、生物及食品加工等领。如抗冻蛋白应用于组织、细胞及微生物的低温保存，可以显著提高其冷冻存活率；抗冻蛋白能减少冷冻食品在低温冻藏过程形成的冰晶及其重结晶对食品造成的品质劣变，提高冷冻食品的稳定性。

抗冻蛋白的抗冻活性主要来源于抗冻蛋白中的某些活性片段，并不是整个蛋白在起作用。汪少芸等人通过酶解技术从牛皮、猪皮及鱼皮等不同来源的胶原蛋白中酶解、分离出具有高抗冻活性的多肽片段。

近年来有研究发现重结晶抑制活性对于抗冻蛋白发挥冷冻保护作用起到了至关重要的作用，然而抗冻蛋白的热滞活性和冰结合特性对于当冻藏温度低于热滞活性温度区间的生物材料（如细胞、血液、组织）反而起到破坏甚至致死作用，主要因为当冻藏温度低于热滞活性温度范围时，冰晶生长不受控制而快速转变成针状结构，进而导致细胞损伤和解冻后细胞存活率的下降。这也是阻碍天然抗冻蛋白（或肽）作为冷冻保护剂进行实际应用的主要因素。因此，近年来国际研究开始致力于开发一些具有重结晶抑制活性而没有热滞活性的新型抗冻蛋白，基于糖基化修饰的抗冻蛋白就是这类活性物质的一种。例如一个由4个 Ser-Gly-Gly 三肽重复的肽链为骨架并通过 Ser 残基的碳端连接一个半乳糖苷基形成的抗冻肽就发现具有很强的重结晶抑制活性而没有热滞活性。此外，研究还发现糖基种类和肽链骨架中糖基化位置及氨基酸残基类型对重结晶抑制活性有着显著的影响作用，如半乳糖基修饰的抗冻肽重结晶抑制活性比甘露糖基修饰的抗冻肽强，而脯氨酸由于具有限制的旋转角可使蛋白在溶液中具有明显二级结构，因此一些含脯氨酸的具有较强的重结晶抑制活性。

果寡糖是一种价格廉价的混合物，由果糖和低聚合度的低聚寡糖组成，而且它被列为具有特殊功能营养和特定功能的食品。在营养方面，它们是膳食纤维的来源，低能量，适合糖尿病患者，无致癌作用，而且是刺激双歧杆菌生长的益菌素。果寡糖也能通过改善稳定性、质地、口感、味道等增加食物的功能性，同时也可以取代糖和脂肪。一种成功的抗冻多肽-果寡糖共聚物可能拥有更加良好的功能性质。

因此，本发明将不同来源的抗冻多肽与果寡糖通过糖基化修饰手段，化学合成抗冻糖肽。所合成的抗冻糖肽的抗冻活性显著高于原始抗冻多肽，可以广泛应用于细胞、组织、器官、微生物及冷冻食品的低温冷冻保存；并且该方法安全、易于控制，可以大规模工业化生产。

发明内容

本发明目的在于针对现有技术不足，提供一种基于果寡糖修饰的抗冻糖肽的制备方法及应用。添加本发明抗冻糖肽的细胞、组织、器官、微生物的冷冻存活率均显著提高；将本发明应用到冷冻保藏食品中，可以很好地保持冷冻食品原有品质的稳定性，显著降低冷冻损伤引起的食品品质劣变。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于果寡糖修饰的抗冻糖肽的制备方法，按照如下方法制备：将抗冻多肽粉和果寡糖之间按照质量比为1:1 ~ 1:5的比例溶解于磷酸盐缓冲液中，溶液最终浓度为5 ~ 15%（w/v），搅拌使其充分溶解；然后在60 ~ 80 ℃、pH为8.0 ~ 9.0条件下反应1 ~ 2 h；反应结束后，立即放在0 ℃的水中冷却以终止反应，反应后的溶液冷冻干燥，得到所述的果寡糖修饰的抗冻糖肽冻干粉。

所述的抗冻多肽粉的原料来源于猪皮、牛皮、鱼皮或鱼鳞。

所述的磷酸盐缓冲液的pH为7.6~8.0，其中 KH₂PO₄为2.6 mM，K₂PO₄为32.5 mM。

所述的搅拌时间为10 ~ 20 min；所述冷却时间为15~30 min。

如上所述的制备方法制得的抗冻糖肽的用途，所述的抗冻糖肽用于细胞、组织、器官、微生物及冷冻食品的低温冷冻保存。

本发明所提供的技术方案具有如下优势：

（1）本发明所用的抗冻多肽原料来源于食品源下脚料，具有安全无毒、来源广泛，价格便宜等优势；

（2）本发明提供的抗冻糖肽合成方法高效、安全、成本低，易于控制；