[发明专利]基于核酸层析生物传感技术检测蜡样芽胞杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物传感检测技术领域，具体地说，涉及一种基于核酸层析生物传感技术检测蜡样芽胞杆菌的方法。

背景技术

蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)，杆状，圆形，菌落直径2.5mm，隆起，表面光滑，边缘整齐，半透明，奶油状，浅黄色，革兰氏染色阴性，氧化酶阳性，接触酶阳性，淀粉酶试验阴性，明胶液化试验阴性，葡萄糖氧化发酵试验为氧化型，不产生硫化氢，硫酸盐还原试验阴性，产生水溶性绿色色素。蜡样芽胞杆菌与少数食物中毒有关(约2–5％)，包括一些严重的恶心、呕吐以及腹痛。大概来说，杆菌性食物中毒是由于错误地烹调方法造成细菌孢子残留在食物上，更糟糕的是食物被不当冷冻而让孢子发芽。细菌繁殖的结果是产生肠毒素，人食用含毒素的食物后会产生呕吐、腹泻等不良症状。

传统的细菌检测方法主要根据生理生化特征，但是传统的检测方法需要经过前增菌、选择性平板分离、生物化学鉴定等步骤，从取样到确定结果需要5-7天，检测周期长，操作繁琐，工作量大；利用抗原抗体反应的特异性，对细菌进行鉴别，已有了半个多世纪的历史，但是微生物抗体的筛选十分繁琐，并且最终的检测特异性不高；分子生物学检测技术的不断完善和发展，克服了传统检测方法实验操作繁琐、耗时长等问题，也使得针对微生物开展的快速检测方法得到迅速发展，但是分子生物学方法的缺点在于不容易分析结果。随着现代生物技术的发展，生物传感器这一比传统方法更快捷、更灵敏的新技术在食品安全检测领域崭露头角。生物传感器具备特异性强、灵敏度高等优点，可以简化分析检测步骤，缩短分析时间，更重要的是使在线实时检测成为可能，便于携带和野外作业，在食品安全领域得到了较快的发展。近年来，众多新材料、新技术的开发和应用正成为研究的热点为生物传感器的发展注入了新的活力，在微生物检测领域显示出巨大的应用潜力。因此建立蜡样芽胞杆菌可靠的、快速的传感器检测方法，特别是能够鉴定死活菌的方法，在日常监控、市场筛查等方面具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于核酸层析生物传感技术检测蜡样芽胞杆菌的方法。

本发明构思如下：开发一种蜡样芽胞杆菌的快速和超灵敏检测方法，特别是能够鉴定死活菌的方法，建立基于叠氮碘化丙啶(PMA)，环介导等温扩增反应(LAMP)和纳米酶试纸的活菌检测的连续级联纳米酶生物传感器。在LAMP反应中，使用荧光素(FITC)修饰的和生物素(BIO)修饰的引物测定蜡样芽胞杆菌的hbl A基因。将PMA与LAMP组合，应用于死活蜡样芽胞杆菌的分离。然后，使用纳米酶探针制备基于磁性颗粒的免疫层析条(纳米酶条)用于检测扩增信号，通过目视检测或利用条形读出器进行结果判读或定量，为现场检测蜡样芽胞杆菌活菌提供快速、超灵敏和便捷的工具。

为了实现本发明目的，本发明首先提供用于检测蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的LAMP引物组，包括(SEQ ID NO:1-4)：

外侧正向引物F3：5’-TGCTATTTTGGGTCTACCAA-3’；

外侧反向引物B3：5’-GTGGACATATAAGTAAGAGCGTTA-3’；以及

内侧正向引物FIP：5’-ACGTAATTCTGCTAATAAAGGCTCTAATT GGCGGTATTATAGTCGG-3’；

内侧反向引物BIP：5’-AACCTTAAATCGTGTAGTTGGAGTTATCA TCAAGCGCCTTGTG-3’。

其中，引物FIP的5’端标记生物素，引物BIP的5’端标记荧光素FITC。

本发明还提供一种纳米酶核酸层析试纸条，所述试纸条的制备方法包括以下步骤：

1)Fe₃O₄磁颗粒的制备；

2)纳米酶探针(MNP)的制备：将Fe₃O₄磁颗粒与生物素二抗进行孵育，得到生物素二抗纳米酶探针；

3)纳米酶核酸层析试纸条的组装：所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中，所述硝酸纤维素膜上设有至少1条检测线和1条质控线；所述结合垫上固定有生物素二抗纳米酶探针；

①分别用FITC抗体和生物素抗体在硝酸纤维素膜上划出检测线和质控线，烘干；

②将上述样品垫、结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜以及吸收垫依次粘贴在底板(塑料衬板)上，完成试纸条的组装。组装好的试纸条的结构示意图见图5。