[发明专利]基于核酸层析生物传感技术检测阪崎肠杆菌的方法

说明书

本发明涉及一种基于核酸层析生物传感技术检测阪崎肠杆菌的方法，根据阪崎肠杆菌的毒力基因ompA，设计环介导等温扩增引物(SEQ ID NO:1‑4)，结合纳米酶核酸试纸条，建立一种基于LAMP纳米酶传感器的阪崎肠杆菌检测方法。本方法可成功地用于区分活菌细胞和死菌细胞，对阪崎肠杆菌的检测下限可达10CFU/mL。

技术领域

本发明涉及生物传感检测技术领域，具体地说，涉及一种基于核酸层析生物传感技术检测阪崎肠杆菌的方法。

背景技术

阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)是一种革兰氏阴性、依靠周生鞭毛运动、无芽孢的兼性厌氧细菌。它是肠杆菌属的一种条件致病菌，该菌引起的食源性疾病可导致婴儿(尤其是新生儿)的脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，报告病例的死亡率达20％-50％，幸存者常遗留严重的神经系统疾病。近年来对食品(奶粉、巧克力、谷类食品、马铃薯、意大利面等)加工厂原料、生产环境及家庭中阪崎肠杆菌污染率的研究发现，阪崎肠杆菌在自然界中分布广泛。在多起阪崎肠杆菌的暴发事件中发现，新生儿阪崎肠杆菌感染与婴儿配方粉密切相关。

传统的细菌检测方法主要根据生理生化特征，但是传统的检测方法需要经过前增菌、选择性平板分离、生物化学鉴定等步骤，从取样到确定结果需要5-7天，检测周期长，操作繁琐，工作量大；利用抗原抗体反应的特异性，对细菌进行鉴别，已有半个多世纪的历史，但是微生物抗体的筛选十分繁琐，并且最终的检测特异性不高；分子生物学检测技术的不断完善和发展，克服了传统检测方法实验操作繁琐、耗时长等问题，也使得针对微生物开展的快速检测方法得到迅速发展，但是分子生物学方法的缺点在于不容易分析结果。随着现代生物技术的发展，比传统方法更快捷、更灵敏的生物传感器新技术在食品安全检测领域崭露头角。生物传感器具备特异性强、灵敏度高等优点，可以简化分析检测步骤，缩短分析时间，更重要的是使在线实时检测成为可能，便于携带和野外作业，在食品安全领域得到了较快的发展。近年来，众多新材料、新技术的开发和应用正成为研究的热点，为生物传感器的发展注入了新的活力，在微生物检测领域显示出巨大的应用潜力。因此建立阪崎肠杆菌可靠的、快速的传感器检测方法，特别是能够鉴定死活菌的方法，在日常监控、市场筛查等方面具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于核酸层析生物传感技术检测阪崎肠杆菌的方法。

本发明构思如下：开发一种阪崎肠杆菌的快速和超灵敏检测方法，特别是能够鉴定死活菌的方法，建立基于叠氮碘化丙啶(PMA)，环介导等温扩增反应(LAMP)和纳米酶试纸的活菌检测的连续级联纳米酶生物传感器。在LAMP反应中，使用荧光素(FITC)修饰的和生物素(BIO)修饰的引物测定阪崎肠杆菌的ompA基因。将PMA与LAMP组合，应用于死活阪崎肠杆菌的分离。然后，使用纳米酶探针制备基于磁性颗粒的免疫层析条(纳米酶条)用于检测扩增信号，通过目视检测或利用条形读出器进行结果判读或定量，为现场检测阪崎肠杆菌活菌提供快速、超灵敏和便捷的工具。

为了实现本发明目的，本发明首先提供用于检测阪崎肠杆菌(EnterobacterSakazakii)的LAMP引物组，包括(SEQ ID NO:1-4)：

外侧正向引物F3：5’-TGGTCCCAGTTCCACGATA-3’；

外侧反向引物B3：5’-ACGCCCTGAGCTTTGAAAG-3’；

内侧正向引物FIP：5’-TAACCTGGTAACCACCGAACGCTATTCCTAACGACGGTCCGA-3’；

内侧反向引物BIP：5’-GTACGTTGGCTTCGAAATGGGCCAGTGTCGCCTTTATACGGC-3’。

其中，引物FIP的5’端标记生物素，引物BIP的5’端标记荧光素FITC。

本发明还提供一种纳米酶核酸层析试纸条，所述试纸条的制备方法包括以下步骤：