[发明专利]基于核酸层析生物传感技术检测大肠杆菌O157的方法

权利要求书

1.用于检测大肠杆菌O157(Escherichia coli)的LAMP引物组，其特征在于，包括：

外侧正向引物F3：5’-GCTGAAGCCTTTGGTTCT-3’；

外侧反向引物B3：5’-TGTAGCCTATAACGTCATGC-3’；以及

内侧正向引物FIP：5’-CCACCTTCACCTGTAGTAATAGTTTTAAAGGTAAATATGTGGGAACAT-3’；

内侧反向引物BIP：5’-AATGGTTGTCACGAATGACAAAACCAATATTGCCTATGTACAGCT-3’；

其中，引物FIP的5’端标记生物素，引物BIP的5’端标记荧光素FITC。

2.一种纳米酶核酸层析试纸条，其特征在于，所述试纸条的制备方法包括以下步骤：

1)Fe₃O₄磁颗粒的制备；

2)纳米酶探针的制备：将Fe₃O₄磁颗粒与生物素二抗进行孵育，得到生物素二抗纳米酶探针；

3)纳米酶核酸层析试纸条的组装：所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中，所述硝酸纤维素膜上设有至少1条检测线和1条质控线；所述结合垫上固定有生物素二抗纳米酶探针；

①分别用FITC抗体和生物素抗体在硝酸纤维素膜上划出检测线和质控线，烘干；

②将上述样品垫、结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜以及吸收垫依次粘贴在底板上，完成试纸条的组装。

3.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，步骤1)中利用水热法合成Fe₃O₄磁颗粒，具体为：将0.6-0.8g FeCl₃·6H₂O溶解在20mL乙二醇中，然后加入1.5-2.0g醋酸钠，搅拌30-40min，然后密封在高压釜中，200℃加热16-18h；磁颗粒产物用乙醇洗涤，并在60℃下干燥；将二氯乙烷和N-羟基琥珀酰亚胺各5-8mg通过涡旋溶解在1mL去离子水中，制得混合液，然后将5-8mg磁颗粒加入混合液中，室温下孵育30-40min，然后用磁铁收集磁颗粒，用超纯水洗涤，即得Fe₃O₄磁颗粒。

4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于，步骤2)具体为：将浓度100μg/mL的生物素二抗加入50mM pH 6.0的醋酸钠缓冲液中，然后与5-8mg的Fe₃O₄磁颗粒混合，将混合物涡旋混合，4℃孵育过夜；用pH7.0的PBS液洗涤混合物，然后在50mM pH7.2的Tris缓冲液中室温孵育30-40min；再用pH7.0的PBS液洗涤，即得到生物素二抗纳米酶探针。

5.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，步骤2)和3)中所述的生物素二抗为羊抗鼠IgG；步骤3)中所述硝酸纤维素膜为Millipore135S。

6.根据权利要求1-5任一项所述的试纸条，其特征在于，步骤3)中检测线设在距硝酸纤维素膜下边缘1.1cm的位置上，质控线设在距硝酸纤维素膜下边缘1.6cm的位置上；检测线与质控线之间的距离为4.5mm，按1.0μL/cm将FITC抗体和生物素抗体分别喷涂在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上，其中检测线和质控线上包被的抗体浓度均为0.5-2mg/mL。