[发明专利]同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的多重PCR引物组、试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，更具体地，涉及一种同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的多重PCR引物组、试剂盒和检测方法。

背景技术

禽流感(Avian Influenza，AI)是由禽流感病毒(AIV)引起的一种禽类急性传染病，同时，某些亚型的禽流感病毒能够感染人类。禽流感病毒为负链单股RNA病毒目正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒，其基因组由8个基因片段组成，分别为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M以及NS，根据其糖蛋白血凝素(HA)与神经氨酸酶(NA)的抗原性不同，可将AIV分为16种HA亚型(H1-H16)，9种NA亚型(N1-N9)。禽流感根据致病性可分为高致病性禽流感与低致病性禽流感，部分H5与H7为高致病性禽流感，能够造成鸡群的大量死亡，特别是近年来频频爆发的H5疫情，给多个国家和地区的养殖业带来巨大的经济损失。在我国，H5N1亚型禽流感病毒在1996年首次在广东省分离得到，随后2003年青海湖爆发H5N1疫情，造成了大量的野鸟的死亡，H5N1迅速传播从亚洲逐步蔓延至欧洲以及非洲在内的56个国家和地区，最近几年，H5N2、H5N6、H5N8亚型禽流感病毒也在国内外不同地区相继爆发疫情，造成了大量的家禽死亡和被扑杀。此外，部分H5亚型禽流感病毒发生了抗原变异，获得了跨种间传播的能力直接感染人并引起死亡的案例也提示了H5亚型不仅给养殖业带来巨大伤害，同时还是人类世界公共卫生的巨大安全隐患。

建立禽流感病毒的快速检测及诊断方法不仅有助于早期发现和控制病情，同时也有利于禽流感的监测及检测技术的储备，为应对流感大流行的出现提供早期的监测数据并及时采取有效的防范措施。禽流感的传统检测方法包括病毒的分离与鉴定，分离AIV的常用方法有鸡胚培养分离法，另外通过血清学检测可以进一步区分病毒的HA及NA亚型，由于禽流感亚型众多而且新的变异株不断出现，虽然病毒分离与鉴定是检测病毒的金标准，但操作繁琐，检测周期长，且容易受抗体等因素影响使检测结果不准确和及时，不利于疾病的诊断及对于疫情的控制；随着生物技术的日益更新和迅速发展，现代分子生物学手段逐渐被用来检测AIV，如实时荧光定量PCR、环介导等温扩增法、基因芯片法以及高通量测序等，这类方法虽然特异性和敏感性较好，但是对于仪器和设备的要求较高，目前还不够普及。聚合酶链式反应(PCR)操作简单，仪器要求不高，耗时短，准确度高的同时，也有着不错的特异性与敏感性，结果更为直观，易于判断，样品保存方便，重检也方便，当日即可完成，建立多重PCR能够同时扩增出多个目的基因片段进而实现多种病原体的快速诊断并降低检验成本。

目前，我国流行的H5亚型禽流感病毒以N1、N2、N6以及N8这四种NA亚型较为常见，而不同NA亚型的H5禽流感的爆发都具有发病急、传播快、症状相似的特点，因此仅凭临床对于病情的观察不能判定具体的NA亚型，而目前用的较多的检测方法均侧重于HA方面的检测，对于能够同时检测H5的HA与其四种常见NA亚型的多重PCR方法则尚未见有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的多重PCR引物组、试剂盒和检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的多重PCR引物组合物，其核苷酸序列分别如下所示：

针对禽流感病毒M基因的引物：

MU：5’-TTCTAACCGACGTCGAAAC-3’；

ML：5’-TTAGTCAGAGTTGACARGAT-3’；

针对禽流感病毒H基因的引物：

H5U：5’-ATGAACACTCARTATGAGG-3’；

H5L：5’-GCATTATCCYTAATCTGTAG-3’；

针对禽流感病毒N1基因的引物：

N1U：5’-TTCGAGTCTGTTGCTTGGT-3’；

N1L：5’-GGAGTATTCCTCATAGTGAT-3’；

针对禽流感病毒N2基因的引物：

N2U：5’-CAATTGGCTCTGYTTGTCT-3’；

N2L：5’-TGGTYCCCTGYCCAATTGC-3’；

针对禽流感病毒N6基因的引物：

N6U：5’-TGCAATCAGAATAGGTGAGG-3’；

N6L：5’-TGCTTGTGTGCGTCATCRT-3’；

针对禽流感病毒N8基因的引物：