[发明专利]基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法

权利要求书

1.基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)全血样本的采集和运输：采集全血样本，样本中添加抗凝剂，常温保存运输；

(2)PBMC细胞分离：采用Ficoll淋巴细胞分离液对全血样本中的细胞进行分离，具体步骤为：用生理盐水/PBS缓冲液/Hanks液将全血样本1：1稀释后，转移至含1倍体积Ficoll淋巴细胞分离液的离心管内，离心，吸出中层白色的PBMC细胞转移至新的离心管中，以无血清DMEM/1640离心清洗后，再用无血清的DMEM/1640重悬细胞沉淀；

(3)细胞活性染色：采用顺铂对分离的细胞进行染色，染色时间控制在5-10min，染色结束后离心去上清液，对细胞进行重悬；

(4)细胞刺激：将细胞转移至培养箱中培养15～30min，使细胞恢复“静息”状态，并根据适当的刺激物及刺激方法对细胞进行分组刺激；

(5)细胞固定：对步骤(4)中重悬的细胞进行PFA固定、冻存；

(6)表面抗体染色：将PFA固定、冻存的细胞融化后，重悬，加入细胞染色缓冲液，离心去除上清后，加入Blocking Mix重悬，常温静置后加入cocktail混匀；

(7)胞内磷酸化蛋白染色：将表面抗体染色后的细胞用PBS缓冲液和甲醇处理后，用cell staining Buffer重悬，加入磷酸化抗体cocktail混匀，常温孵育之后用CellStaining Buffer清洗去上清；胞内磷酸化蛋白染色的具体步骤为：将表面抗体染色后的细胞用PBS缓冲液混匀后放置冰上，然后加上预冷的甲醇混匀，放置冰上15min以上，离心弃上清，用cell staining Buffer重悬，加入等体积的磷酸化抗体cocktail混匀；

(8)单细胞标记：步骤(7)中染色后的细胞用PBS缓冲液重悬，滴入含有金属元素标记物的cell intercalation溶液进行标记，随后分别用Cell Staining Buffer和水进行清洗，最后将细胞重悬于含有EQ beads的水中保存。

2.根据权利要求1所述的基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法，其特征在于：所述步骤(1)中全血样本常温保存的温度范围为15-35℃。

3.根据权利要求1所述的基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法，其特征在于：所述步骤(1)中的抗凝剂为肝素或者柠檬酸盐。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法，其特征在于：步骤(4)中所述的刺激物为可以引起细胞蛋白和基因调控变化的药物或激酶，包括但不限制于阿霉素、紫杉醇、干扰素、生长激素。

5.根据权利要求4所述的基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法，其特征在于：步骤(5)中细胞固定的具体步骤为：将步骤(3)中重悬的细胞加入等体积的2×固定液混匀，孵育后加入0-4℃的Cell Staining Buffer，然后离心分离，用冻存液重悬细胞。

6.根据权利要求5所述的基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法，其特征在于：步骤(6)的Blocking Mix溶液中包括Fc Receptor Blocking Solution和CellStaining Buffer，两者的体积比为1:10；cocktail溶液中含有抗体。

7.根据权利要求6所述的基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法，其特征在于：步骤(6)的活性染色培养基中含有0.5％BSA+0.02％NaN₃。

8.根据权利要求5所述的基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法，其特征在于：步骤(8)中的金属元素标记物为Ir或者Rh。