[发明专利]一种优化的RNA高通量测序文库构建的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种优化的RNA高通量测序文库构建的方法及其应用。

背景技术

以Illumina测序平台为代表的下一代测序（Next-generation Sequencing，NGS）目前已经在DNA测序领域、RNA测序领域等具有广泛的应用。RNA-seq可以把mRNA、小RNA、非编码RNA、RNA病毒等的RNA序列利用高通量测序技术一次实验测序获得。

通常构建RNA测序文库一般包括以下步骤：将RNA片段采用机械法或酶法打断到一定长度、纯化打断的RNA、利用随机引物进行反转录、合成cDNA二链、末端修复和加A加接头、纯化、index PCR扩增和index PCR产物纯化。这样的建库方法包括三次繁琐的纯化步骤，对实验试剂、耗材、时间和人力造成了很大的浪费。同时，建库过程中需要采用随机引物，随机引物有时会带来反转录的不平衡，给测序结果带来一定偏差。

为了消除RNA测序文库过程中存在的随机引物影响，减少纯化步骤，本发明提出了采用片段化的RNA直接连接接头，避免了随机引物的使用；将纯化步骤由三步减少到两步纯化，大量节约了人力物力，同时提高了RNA文库构建的质量和效率。

发明内容

第一方面本发明提供了一种优化的RNA高通量测序文库构建的方法及其应用，所述的方法进行RNA高通量文库构建消除了RNA测序文库过程中存在的随机引物影响，减少了纯化步骤，大量节约了人力物力，同时提高了RNA文库构建的质量和效率。

为解决上述技术问题，本发明的具体实施方式提供了一种优化的RNA高通量测序文库构建的方法，本方法采用以下技术方案。

本发明提供一种优化的RNA高通量测序文库构建的方法，所述方法采用RNase III进行待测RNA样本打断、采用RNA连接酶连接接头、采用反转录酶和热启动高保真DNA聚合酶体系进行一步法反转录和加标签PCR构建高通量测序文库。

本发明所述的待测RNA样本可以为mRNA样本、rRNA样本、单链病毒RNA样本、lncRNA样本等各种类型的用于高通量测序文库构建的RNA样本。

本发明采用RNase III对所述待测序RNA样本进行打断，打断后的RNA片段带有突出的5’端磷酸基团和3’端羟基基团，无需经过其他处理，纯化后即可直接用于接头连接。

本发明采用Agencourt RNAClean XP Beads（Beckman Coulter公司产品）对打断后的RNA片段进行纯化，可以对打断后的RNA片段进行高效回收纯化。

本发明采用T4 RNA连接酶I对纯化后的mRNA片段进行加接头反应，T4 RNA连接酶I可以高效的连接单链RNA接头的3’末端羟基基团和纯化后的mRNA片段5’末端磷酸基团，同时，T4 RNA连接酶I可以高效的连接单链DNA接头的5’末端磷酸基团和纯化后的mRNA片段的3’末端羟基基团。连接反应后，纯化后的mRNA片段5’端连入人工合成的单链RNA接头，3’端连入人工合成的单链DNA接头。

本发明提供的单链RNA接头和单链DNA接头序列为但不局限于Illumina测序平台通用接头序列，Illumina测序平台接头序列如下面NO.1和NO.2所示：

NO.1: 5’-ACACUCUUUCCCUACACGACGCUCUUCCGAUCU-3’

NO.2: 5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’。

本发明采用一步法反转录和cDNA index PCR，所述反转录反应采用多点突变改造的反转录酶Thermo-script RTase进行反转录，具有更好的延伸能力和稳定性；所述cDNA index PCR反应采用热启动高保真DNA聚合酶进行cDNA index PCR，具有更好的保真性，反应产物纯化可以直接用于Illumina测序平台进行测序。

本发明采用SPRISelect磁珠（Beckman Coulter公司产品）对index PCR产物进行片段筛选和纯化，SPRISelect磁珠可根据实验需要纯化目的大小的DNA片段，用于后续测序反应。

第二方面，本发明提供一种优化的RNA高通量测序文库构建的试剂盒，所述试剂盒第一方面所述的RNase III及其缓冲液、T4 RNA连接酶I及其反应缓冲液、单链DNA和单链RNA接头、反转录酶Thermo-script RTase、热启动高保真DNA聚合酶及其反应缓冲液和index PCR引物。