[发明专利]一种快速检测副猪嗜血杆菌血清4型的方法

说明书

本发明通过提供一种副猪嗜血杆菌血清4型的特异性基因片段及具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测样品中是否存在副猪嗜血杆菌血清4型特异性基因片段进而确定样品是否为副猪嗜血杆菌血清4型。本发明检测试剂和检测方法具有敏感性高(对副猪嗜血杆菌血清4型基因组DNA的检测敏感度为1.0pg，对副猪嗜血杆菌血清4型菌液的检测敏感度为1.6×10²cfu/mL)、特异性强、方便快捷、不需要特殊仪器、适用范围广等优点，可解决副猪嗜血杆菌血清4型的现场快速检测和基层普及应用的难题。

技术领域

本发明涉及病原菌的快速检测方法技术领域，尤其是涉及一种快速检测副猪嗜血杆菌血清4型的方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是一种重要的猪呼吸道病原菌，目前已至少鉴定出15个血清型，不同血清型菌株之间存在高毒力、中等毒力和无毒力等显著差异，鉴定HPS血清型对该病的诊断和防治具有重要意义。HPS血清4型是高毒力菌株，又是我国目前流行最多、分布范围最广的血清型之一。目前该菌常规血清型鉴定方法为细菌分离培养和鉴定的基础上，通过琼脂扩散试验与HPS所有血清型的阳性血清进行反应来判定血清型，通常需要3-5天的时间，费时费力，而且约有30％的HPS分离菌株不能被准确鉴定出血清型，严重影响副猪嗜血杆菌病的快速诊断和检测。

环介导等温扩增技术(LAMP，国际专利公开号WO 00/28082)是2000年Notomi等开发出的一种核酸扩增新技术，即针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物(如需要还可以添加环引物对)，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在65℃左右恒温条件保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应，扩增结果可通过凝胶电泳进行检测。用于LAMP技术扩增的2对引物是针对靶基因序列的6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时也具备不需要热循环、扩增效率更高、不需要特殊仪器等优点。

副猪嗜血杆菌感染的流行病学研究主要利用血清学分型方法开展，即在HPS分离培养和鉴定的基础上，通过琼脂扩散试验与HPS所有血清型的阳性血清进行反应来判定血清型，通常需要3-5天的时间，费时费力，而且约有30％的HPS分离菌株不能被准确鉴定出血清型，严重影响副猪嗜血杆菌病的快速诊断和检测。

发明内容

本发明的技术目的是建立一种简便、快速、高灵敏度、高特异性、高准确度的HPS血清4型LAMP检测方法。

为快速准确地鉴定HPS血清4型，本发明参考GenBank发表的副猪嗜血杆菌SW124菌株的脂多糖合成蛋白(lipopolysaccharide biosynthesis protein，wciP4)基因序列(登录号KC795356.1)，运用引物设计软件Primer Explorer 4.0，在线进行LAMP引物设计。按照引物设计原则，针对其6个特定区域设计4条引物：两条外引物分别为上游外引物(F3)和下游外引物(B3)；两条内引物分别为上游内引物(FIP)和下游内引物(BIP)，FIP由F1的互补序列和正向序列F2构成，BIP由B1的互补序列和正向序列B2构成，靶基因片段即为上游外引物F3与下游外引物B3之间的基因序列。依据Primer Explorer 4.0设计的引物，可获得多个靶基因片段，然后运用BLAST进行序列比对，筛选出wciP4基因特异性高且高度保守的靶基因片段(如SEQ ID No.5所示)。创新性发现，此wciP4基因特异性片段经LAMP方法扩增，仅在恒温条件下(62℃)反应60分钟，即可将目的DNA从几个拷贝扩增到10⁹个拷贝，通过电泳检测扩增产物来判定结果。故而可作为一种运用LAMP技术快速检测HPS血清4型方法的分子标记使用。

在此基础上，本发明进一步提供一组环介导等温扩增引物，其可特异性环介导等温扩增所述的分子标记。根据一种优选的实施方式，所述引物组包括上游外引物F3和下游外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示；以及上游内引物FIP和下游内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID No.3-4所示。