[发明专利]一种大量组织、细胞样本mRNA的分子条形码标记、文库构建、测序的方法

权利要求书

1.一种用于对大量组织、细胞样本信使核糖核酸逆转录的含分子条形码的寡核苷酸引物序列组合，其特征在于：该序列组合含多个不同且唯一的条形码及oligo-dT的寡核苷酸链。

2.根据权利要求1所述的寡核苷酸引物序列组合，其特征在于：所述寡核苷酸链为：Z1-X(N)-T(18-30)，其中X(N)是任意不同且唯一的分子条形码(barcode)序列，一个X代表ATGC四种脱氧核糖核酸碱基中的任意一个碱基，N为6-8，Z1为任意illumina i5测序引物序列，T(18-30)为18-30个连续脱氧核糖核酸T碱基。

3.一种通过逆转录对大量组织、细胞样本mRNA分子进行条形码标记的方法，其特征在于：该方法包括：

mRNA的提取、mRNA添加分子条形码、逆转录：每个样本加入含唯一且不同条形码及oligo-dT的寡核苷酸链作为特异逆转录引物，进行逆转录，其中所述寡核苷酸链为：Z1-X(N)-T(18-30)，其中X(N)是任意不同且唯一的分子条形码序列，一个X代表ATGC四种脱氧核糖核酸碱基中的任意一个碱基，N为6-8，Z1为任意illumina i5测序引物序列，T(18-30)为18-30个连续脱氧核糖核酸T碱基。

4.一种用于对大量组织、细胞样本构建3’端二代测序文库的方法，其特征在于：所述大量组织、细胞样本是含polyA尾巴的mRNA的真核生物的正常或异常病变的组织、细胞样本，该方法包括如下步骤：

1)、mRNA的提取；

2)、mRNA添加分子条形码、逆转录：每个样本加入含唯一且不同条形码及oligo-dT的寡核苷酸链作为特异逆转录引物，进行逆转录，其中所述寡核苷酸链为：Z1-X(N)-T(18-30)，其中X(N)是任意不同且唯一的分子条形码序列，一个X代表ATGC四种脱氧核糖核酸碱基中的任意一个碱基，N为6-8，Z1为任意illumina i5测序引物序列，T(18-30)为18-30个连续脱氧核糖核酸T碱基；

3).合成第二条cDNA链

将大量标记有不同barcode序列的样本通过内参基因荧光定量QPCR检测每个样本的相对摩尔浓度；

根据每个样本的相对摩尔浓度，将标记有不同条形码的逆转录产物等摩尔浓度混合，并经AMPure XP磁珠纯化；将混合、纯化后的逆转录产物，利用NEB第二条cDNA链合成试剂盒合成第二条cDNA的链。

4)文库构建

首先将大量标记有不同barcode序列的双链cDNA样本，经AMPure XP磁珠(Beckman Coulter)纯化后，根据样本浓度，将其用TE(Tris,EDTA,PH7.4)稀释至0.2-1ng/μl，取1.25μl，加入3.75μl预混液[Nextera XT(Illumina)试剂盒中的Tagment DNA Buffer(2.5μl)和Amplification Tagment Mix(1.25μl)],涡旋20s，3000g离心5min后，在PCR仪上反应[55℃,10min；10℃,5min]；等温度降到10℃后，马上在反应体系中加入1.25μl NT Buffer终止反应；涡旋20s，3000g离心5min；然后在上述反应体系中依次加入：3.75μl Nextera PCR Master Mix(NPM)，1.25μl的i5端PCR引物，1.25μl i7引物，涡旋20s，3000g离心2min后，在PCR仪上反应[72℃,3min；95℃,30s；12循环(95℃,10s；55℃,30s；72℃,60s)；72℃,5min；10℃,5min；]；上述为总反应体系12.5μl，当对最终测序文库的产量需求较大，根据实际需求按倍数放大上述建库反应中每一步的试剂的体积。

5.根据权利要求4所述的用于对大量组织、细胞样本构建3’端二代测序文库的方法，其特征在于：所述的i5端PCR引物序列为AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-Z2,Z2为步骤2对应的illumina i5测序引物Z1的5’端部分14-20个碱基序列；所述的i7引物为Nextera XT(Illumina)试剂盒的i7引物序列。