[发明专利]一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产衣康酸的构建方法

权利要求书

1.一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产衣康酸的构建方法；其特征在于：以树干毕赤酵母(Pichia stipitis)FPL-UC7为宿主菌株，异源表达CAD基因和过表达ACO基因，构建获得发酵木糖生产衣康酸工程菌株，其构建步骤如下：

(1)密码子优化土曲霉CAD基因，并进行全基因合成；

(2)设计树干毕赤酵母定位细胞质的ACO基因引物；ACO基因扩增引物序列

ACO-F 5’-ATTTGCGGCCGCCTCAGAACTGCTGTCAGA-3’

ACO-R 5’-TCCGTCGACGATCAATGCTCGTCA-3’；

(3)以树干毕赤酵母FPL-UC7基因组DNA为模板，扩增ACO基因片段；

(4)建立连入CAD和ACO编码基因的过表达载体pY26TEF-GPD-IA1；将全基因合成的CAD基因扩增后，用BamHI-EcoRI双酶切，与同样用BamHI-EcoRI双酶切的pY26TEF-GPD质粒连接，获得质粒pY26TEF-GPD-CAD；将质粒pY26TEF-GPD-CAD和ACO基因分别用NotI-SacII双酶切，连接后即获得过表达质粒pY26TEF-GPD-IA1；

(5)电转化过表达载体pY26TEF-GPD-IA1到树干毕赤酵母FPL-UC7感受态细胞，对转化菌株进行木糖补料发酵实验；木糖补料发酵条件为：1.5vvm通气量、100-400rpm保证溶氧量不低于10％，pH恒定维持6.5，发酵72h补加60mL的无菌500g/L木糖溶液；

发酵培养基组成为：木糖20-40g/L，无氨基酵母氮源(YNB)1-2g/L，尿素1-3g/L。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤(1)CAD基因扩增引物序列

CAD-F 5’-CGCGGATCCCGGTGTTACCTCTGAGATCTGTCAC-3’

CAD-R 5’-CCGGAATTCATGGAGACTTAACAGGGCAGTTCAA-3’。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤(5)将过表达载体质粒扩增提纯后，采用电转化方法转入宿主菌株，通过尿嘧啶营养缺陷型固体平板筛选，筛选获得发酵木糖生产衣康酸的树干毕赤酵母合成菌株，然后对该合成菌株进行发酵试验，检测衣康酸产量。