[发明专利]一种褐藻胶裂解酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株褐藻胶裂解酶基因及其应用。

背景技术

我国拥有广阔的海域面积，其中蕴含着丰富的海洋生物资源，尤其是海藻资源。褐藻主要包括海带、裙带等，其细胞壁中富含的褐藻胶是一种直链酸性多糖，在天然状态下，褐藻胶的主要存在状态为水溶性的褐藻酸钠(sodium alginate)、褐藻酸钾等褐藻酸盐类和水不溶性的褐藻酸(alginic acid)。目前市场上的褐藻酸钠(商品名为海藻酸钠)或其他褐藻酸盐主要是从褐藻中获得。研究发现降解褐藻酸钠所得到的寡糖具有多种生物活性，比如免疫调节、促生长、诱导植物抗性和提高蛋白质稳定性等，因而可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加和医药等领域(刘航,天然产物研究与开发,2012,24:201-204)。褐藻酸钠可用多种方法降解，包括化学降解法、物理降解法和酶降解法。化学降解法以酸降解为主，但该方法降解条件难以控制，操作较复杂，耗时长。物理降解法包括辐射法和超声法等，一般与其他降解法一起使用，降解产物的极限分子质量为50kDa左右，不易制得寡糖。而用褐藻胶裂解酶降解褐藻酸钠具有降解条件温和，得率高等优点，且因为酶的底物专一性，能为后续研究寡糖化学结构提供信息，故而褐藻胶裂解酶逐步成为优先降解褐藻酸钠的方法。另外，褐藻胶裂解酶还能应用于肺囊肿性纤维化症的治疗、海藻饲料加工及海藻遗传工程等领域的研究(Wong TY et al.Annual Review of Microbiology,2000,54:289-340)。

褐藻酸裂解酶来源于海洋动植物和多种微生物(包括海洋细菌、土壤细菌和真菌)。褐藻酸钠裂解酶按其底物专一性可分为两大类：1,4-D-甘露糖醛酸片段裂解酶(EC4.2.2.3)和1,4-L-古罗糖醛酸片段裂解酶(EC 4.2.2.11)。至今，褐藻胶裂解酶的生产大多依赖原始产酶动植物或微生物来获得酶蛋白，此种方法虽然能有效的获得一定量的酶蛋白，但产量有限，成本较高，较难满足实际应用需求。随着生物技术的发展，提供了利用基因工程高效生产褐藻胶裂解酶的技术方法。Dong Eun Kim等根据已知的相关功能基因的相似序列设计PCR引物，从Streptomyces sp.ALG-5菌株中克隆到了一个褐藻胶裂解酶基因，并在Escherichia coli BL21(DE3)中成功表达(Kim et al.Marine Biotechnology.2009.11:10-16)。采用这一策略必须对相关基因序列有一定的了解才能设计PCR引物，并且找到的是某一类结构或功能相似蛋白质中的新分子，较难发现全新的基因。

随着高通量测序技术的不断发展，越来越多的产褐藻胶裂解酶的微生物基因组序列得以测定，这使得通过基因组挖掘技术来分析序列信息，对编码褐藻胶裂解酶的基因进行钓取变得简洁快速，Badur AH等对来源于海洋的一株细菌Vibrio splendidus的基因组进行序列测定，通过分析发现该菌株中含有4个编码褐藻胶裂解酶的基因，对其进行了基因克隆和在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的重组表达(Badur et al Appl.Environ.Microbiol.2015.81：1865-1873)；目前获得褐藻胶裂解酶大多数是专一性降解均聚甘露糖醛酸的褐藻胶裂解酶，少数是具有具有降解古洛糖醛酸活性的褐藻胶裂解酶，而具有广泛底物特异性的褐藻胶裂解酶则非常稀少，只有来源于Pseudoalteromonas sp.的褐藻胶裂解酶Aly-SJ02(李建伟,Marine Drugs,2011,21:1374-80)，来源于白蚁肠道的Isoptericola halotolerans的褐藻胶裂解酶AlyIH(窦文芳等,Carbohydrate Polymers,2013,98:1476-82)等具有广泛底物特异性的酶活力较低，而且稳定性差，其中AlyIH只是获得了纯化的酶，尚未获得其编码基因，不能进行重组表达和分子改造；而且大多数褐藻胶裂解酶活性较低。本发明涉及的重组褐藻胶裂解酶具有高活性和高稳定性的特点，其降解产物为低聚合度(主要是二糖、三糖和四糖)的褐藻胶寡糖，具有重大的工业化应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种新型褐藻胶裂解酶。

本发明还要解决的技术问题是，提供包含上述褐藻胶裂解酶的基因工程菌及其构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述褐藻胶裂解酶的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：