[发明专利]一种检测临床疾病基因拷贝数改变的方法WECA

说明书

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种能实现被检测基因外显子全覆盖的检测临床疾病基因拷贝数改变的方法。

背景技术

目前常规染色体检验可以检测5M个核酸碱基以上的染色体长短的改变。高密度芯片检测可以检测50k到5M个核酸碱基大小的基因扩增或缺失，即基因拷贝数改变。高通量测序技术(NGS)可以检测到50-500k大小的基因拷贝数改变，但生物信息分析技术尚在发展中，NGS检测基因拷贝数改变的检出率还很有限。高密度芯片及NGS均有成本贵，周期长的缺陷。而对十几个碱基到几万个碱基的基因扩增或缺失，目前常用MLPA技术。MLPA技术是欧洲发明的技术，基本形式是采用特定的试剂盒，进行多重PCR扩增，再进行片段分析。MLPA的主要缺点是商用特定试剂盒种类非常有限，每个试剂盒只针对一种遗传病，而遗传病种类繁多，至少有8千种以上，很多可能与基因拷贝数改变有关，检测覆盖率极低；开发生产试剂盒的程序复杂，需要用到噬菌体，一般实验室针对新病种新基因难以开发新检测方法；引物都比较长，检测样品量少时，成本比较高；涉及到DNA链接酶，耗时而且效率不稳定；扩增片段用外显子的很小的一个片段代表全部外显子，代表性严重不足，容易漏诊。

发明内容

基于现有技术中存在的不足，本发明提供一种检测临床疾病基因拷贝数改变的方法，英语缩写为：WECA(whole exon gene copy number analysis)，其主要针对MLPA的缺点而设计，方法简洁，灵活，稳定，实现被检测基因外显子全覆盖，一般实验室可以针对一个新遗传病的致病基因，在1-2周内用常规的分子生物学方法建立起稳定可靠的基因拷贝数检测的方法，从而用于数目广大的遗传病的临床检测。

本发明通过以下技术方案达到目的：

一种用于检测基因拷贝数改变的引物，其特征在于：第一轮扩增引物包括在5’端的一段由10-40个任何碱基组成的通用性扩增序列，及3’端的一段由10-40个碱基组成的待测基因的外显子或内含子序列的一段序列或其修改序列；第二轮扩增引物为第一轮扩增的通用引物部分的5末端序列部分，并且直接或间接带有荧光标记或其它能被毛细管电泳仪检测出信号的标记。

一种检测基因拷贝数改变的方法，其包括多重PCR扩增，毛细管电泳和进行基因拷贝数分析三个步骤，其特征在于：使用如权利要求1所述的引物作为多重PCR扩增的引物；多重PCR扩增区域覆盖待检基因的全部外显子的全部碱基；PCR扩增可以设定基因组内参用于样品扩增均一化分析，其内参可以是人GAPDH，b-actin，或同一染色体的10M以外的一个已知基因的序列片段；毛细管电泳可以用ABI或其它商用或自建的毛细管电泳系统；拷贝数分析可以用内参峰高均一化处理不同扩增池的扩增效率，再用检测片段峰高比对内参片段峰高，或基因组上邻近数个片段峰高均值，或直接比对基因组上邻近数个片段峰高均值而得到拷贝数信息。

多重PCR扩增可以有一个或多个扩增池组成；多重PCR扩增池内的各片段长度为60-1000个碱基对，各片段之间长度相差超过3个碱基对；多重PCR扩增通过模板量及扩增循环数的调节实现基本的线性扩增；第一轮及第二轮PCR扩增可以在普通PCR扩增仪或定量PCR扩增仪上进行。

根据上述描述设计的的基因拷贝数改变的检测方法，用于科研，或人肿瘤，血液病，遗传病等临床疾病的诊断检测。

根据上述描述所设计或修饰设计的基因拷贝数检测的方法，检测试剂盒，或检测平台。

本发明的有益效果：WECA设计简洁、步骤简单，有基本分子生物学技术能力的实验室都可以自行设计，不受试剂盒的限制。

WECA的引物可以直接商业化学合成，只要提供引物序列就行，不需要用到噬菌体，一般实验室也能针对新病种新基因开发新检测方法，且WECA所使用的引物一般在35个碱基对左右，比现有技术MLPA的引物短，引物合成难度比较小，错误率也较低，成本比较低。

WECA不需要使用链接酶，耗时短而且效率稳定，条件成熟后直接进行两轮PCR扩增就可以做毛细管电泳分析，一个工作日完成全部检测测序。

MLPA扩增片段用外显子的很小的一个片段(35个碱基左右)代表全部外显子，而现实中一个碱基并不能代表相邻的其它碱基的(片段外侧的)，有些基因的外显子有几千个碱基大小，MLPA代表性严重不足，容易漏诊；而WECA的设计覆盖被检测基因的所有外显子的所有碱基的，至少在所有外显子及其邻近内含子区域实现全覆盖。