[发明专利]从胎盘分离间充质干细胞的方法和使用的消化酶组合物

权利要求书

1.从胎盘中分离间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：

(a)取胎盘小叶，用PBS缓冲液充分冲洗，以去除胎盘中残留的血液；

(b)将胎盘小叶剪成块状，加入含有组织消化酶的PBS缓冲液，再在37℃孵育10~20分钟消化；

(c)将组织块用铜网过滤，研磨以促使过滤；

(d)将收集的过滤液离心，分离单个核细胞，再用MSC培养基悬浮所获得的细胞，然后在37℃、5%CO₂培养箱中培养；

(e)待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞；

(f)针对步骤(e)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、HLA-ABC/DR配型；

(g)将步骤(e)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；

(h)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(g)的冻存细胞进行关联，

其中，在步骤(b)中，所述PBS缓冲液中包含0.02mg/mL dispase、0.05mg/mL胰酶、0.02mg/mL DNase I、0.05mg/mL胶原酶IV、0.2mg/mL透明质酸酶、0.2~0.5mg/mL谷氨酸钠和2~5mg/mL甘露糖。

2.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(a)是在产后四小时之内，在无菌条件下将胎盘小叶剪下，用含10%体积胎牛血清的PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶去除胎盘小叶中残留的血液。

3.根据权利要求1的方法，其中在步骤(b)中，在37℃孵育10分钟。

4.根据权利要求1的方法，其中在步骤(b)中，在37℃孵育20分钟。

5.根据权利要求1的方法，其中在步骤(b)中，所述PBS缓冲液中包含0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、或0.5mg/mL的谷氨酸钠以及2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、或5mg/mL的甘露糖。

6.根据权利要求1的方法，在步骤(e)中，待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞60～90%融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞。

7.根据权利要求1的方法，在步骤(h)中，所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括：细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、胎儿及其父母的详细资料。

8.根据权利要求1至7任一项的方法，其中所获得的胎盘间充质干细胞的细胞纯度大于95%。

9.一种在从胎盘分离间充质干细胞的方法中使用的消化酶组合物，该消化酶组合物是含有组织消化酶的PBS缓冲液，该含有组织消化酶的PBS缓冲液是在PBS缓冲液中包含下列的消化酶：dispase、胰酶、脱氧核糖核酸酶I即DNase I、胶原酶IV、透明质酸酶；含有所述消化酶的PBS缓冲液中包含：0.02mg/mL dispase、0.05mg/mL胰酶、0.02mg/mL DNase I、0.05mg/mL胶原酶IV、0.2mg/mL透明质酸酶、0.2~0.5mg/mL谷氨酸钠和2~5mg/mL甘露糖。