[发明专利]一种淬灭酶产业化生产中酶活力的快速精确检测方法

说明书

本发明提供了一种新型饲用酶制剂产业化的检测方法，即淬灭酶酶活的HPLC检测方法。本发明提供的用于检测淬灭酶酶活的HPLC方法，其流动相选择乙腈和三乙胺水溶液；所述方法还包括，在HPLC检测前，还对淬灭酶样品进行了抽提和稀释，所述抽提的提取液和稀释液为含有曲拉通或牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。实验证明，本发明提供的淬灭酶酶活的HPLC检测方法重复性和时效性好，准确性高。

技术领域

本发明属于酶制剂技术领域，具体涉及一种新型酶制剂产业化的检测方法，即淬灭酶生产中酶活力的快速精确检测方法。

背景技术

N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)是许多革兰氏阴性菌群体感应系统中的信号分子，能够调节许多动植物病原菌致病菌基因的表达。研究发现AHLs的降解对细菌群体的生长并没有影响，但是能够抑制群体间的信号传递，从而使依靠群体感应来调节致病基因表达的病原菌毒性降低甚至丧失。这个发现为生物农药和疾病治疗提供了新的方法和思路。N-酰基高丝氨酸内酯酶可以水解AHLs的内酯键，使信号分子失去活性，从而降低病原菌产生的危害。因此对N-酰基高丝氨酸内酯酶的研究成为当前农业和医药领域的研究热点。

北京挑战生物技术有限公司和中国农业科学院饲料研究所历经5年联合研发，获得了国际领先高科技生物新产品-水产专用淬灭酶，其起效成分是N-酰基高丝氨酸内酯酶。作为国内唯一一家将N-酰基高丝氨酸内酯酶产业化的企业，多年来在淬灭酶的酶学特性分析、改进以及应用方面开展了大量的研究和推广工作。研究中包含淬灭酶产业化检测方法的建立。目前，已报道的淬灭酶检测方法主要有液相色谱法和生物传感器法两种，这两种方法都是通过测定酶的作用底物N-酰基高丝氨酸内酯(以下简称AHLs)的减少量来定义酶活力的大小。

生物传感器法是目前应用最广泛的淬灭酶定性检测方法，其主要原理是采用AHLs结构基因缺失菌株作为指示菌株，该菌株自身不能合成AHLs。在外源AHLs的作用下，它们能够发光、变色或者表达β-半乳糖苷酶活性，因而具有检测AHLs的功能。然后根据指示菌发光强弱或颜色变化距离来测定反应液中AHLs的残留量，通过计算可以得出AHLs的消耗量，进而计算出淬灭酶的酶活。利用细菌生物传感器法是检测AHLs的有效手段，该方法简单、易得、不需要昂贵的设备。基于A.tumefaciens和C.violaceum的细菌生物感应器是最常用的两种生物感应器。但是，由于该方法受操作人员和环境的影响较大，其定量的准确性和重复性较差。在实际应用过程中，该方法多用于AHLs产生菌株和淬灭酶表达菌株的筛选。此外，该生物法检测周期在24h以上，而在生产过程中需要快速检测酶活以便于指导发酵过程的控制以及半成品、成品的加工。因此，基于生物传感法所存在的检测精度低、可重复性差、时效性差的特点，该方法是满足不了产业化检测需求的。

液相色谱法是利用AHLs在201nm下具有强吸收，以峰面积和标准底物浓度建立标准曲线，根据反应液中底物的峰面积值计算出反应液中AHLs的残留量，通过计算得出AHLs的消耗量和淬灭酶的酶活。与生物传感器检测法相比，液相色谱法受人员操作和环境的影响小，检测时长短，适合生产过程中AHLs的定量检测。但目前采用该方法测量的精确度和重现性较差，还不能用于淬灭酶的精确测量。

综上，通过对已报道的酶活检测方法进行的测试和分析，发现已有的淬灭酶检测方法存在测量精度低、重现性差、测量周期长等缺点，难以满足淬灭酶产业化过程中的检测需求。

发明内容