[发明专利]在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子的方法。

背景技术

表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)是许多哺乳动物中存在的一种由53个氨基酸组成的促细胞有丝分裂多肽。EGF能促进蛋白及DNA的合成、细胞的增殖和分化。临床应用上，EGF对人和动物肠道健康有重要作用，有助于保护肠道屏障的完整性，有利于肠道发育，维持小肠上皮细胞稳态，促进仔猪胃肠上皮细胞的成熟，降低断奶仔猪的应激，提高断奶仔猪的免疫功能，是有效的肠道调节剂。此外，EGF能刺激静止期猪卵母细胞的成熟，加速卵子的排出，提高母猪的繁殖率。因此，猪EGF在畜牧业发展中有重要的应用前景。

动物内源性EGF分泌量少不能满足机体的需求，目前运用生物技术表达外源性EGF的工程菌有大肠杆菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母。实际生产应用中，对于生产生物蛋白产品基因工程菌的要求为，遗传背景清晰，遗传性质稳定，易于基因操作，培养成本低，产量高，无毒副产品。毕赤酵母具有已经商业化，较为成熟的表达系统。但目前报道使用酵母表达EGF的浓度较低，仅为30mg/L(Wang et al.,2014)，因此，急需更为高效的酵母表达系统满足大规模生产需求。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种能够在毕赤酵母中高效地表达重组猪表皮生长因子的方法。

为此，本发明提供了如下技术方案。

一种在毕赤酵母中高效表达重组猪表皮生长因子的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)构建重组猪EGF表达载体pJ912-pEGF：人工合成猪EGF核苷酸序列，在所述猪EGF核苷酸序列的5’端和3’端分别加入SmalI和PstI酶切位点，得到猪EGF合成产物，用SmalI和PstI双酶切表达载体pJ912并进行回收，将回收后的表达载体pJ912与所述猪EGF合成产物用T4DNA连接酶连接以构建重组质粒pJ912-pEGF；

(2)用重组质粒pJ912-pEGF电转化毕赤酵母X-33：将重组质粒pJ912-pEGF的DNA用SwaI酶切，线性化，用苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀法进行纯化；纯化后的线性质粒DNA溶解于10ul无核酸酶水中；再用纯化后的线性质粒DNA电转化毕赤酵母X-33；得到重组子。

(3)生物发酵表达猪EGF。

优选地，所述猪EGF核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述表达载体pJ912含有SmalI和PstI酶切位点、AOX1启动子、α因子分泌信号序列。

优选地，所述步骤(2)中，电转化时使用的电比色皿宽0.4cm，电转化的条件为：电压1.5kv，电击4ms。进一步，电击过程在冰上进行。

优选地，所述步骤(2)还包括将所述重组子涂布于YPD琼脂培养基平板上筛选。更优选地，所述YPD琼脂培养基的成分为1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％琼脂、1M山梨醇和100ug/ml博来霉素。

优选地，所述步骤(2)还包括用以下引物对所述重组子进行PCR扩增筛选，筛选出阳性重组子；所述引物序列如下：

上游引物:5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’，

下游引物：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。

优选地，在小规模生物发酵表达猪EGF中，所述步骤(3)的生物发酵表达条件为：甘油培养温度为30℃，甲醇诱导温度为25℃，甲醇诱导体积浓度为1％，pH值为5.5。

优选地，在大规模生物发酵表达猪EGF中，所述步骤(3)的生物发酵表达条件为：甘油培养温度为30℃，甲醇诱导温度为26℃，甲醇体积浓度为2％，pH值为5.5。

与现有技术相比，本发明的方法能够实现在毕赤酵母中更高效地表达重组猪表皮生长因子。

附图说明

图1为重组表达质粒pJ912-pEGF的构建图。

图2为PCR检测阳性重组毕赤酵母的结果。

图3为用蛋白质印迹法比较不同猪EGF拷贝数重组酵母中猪EGF表达量的结果。

图4为用蛋白质印迹法检测重组酵母菌株不同发酵时间猪EGF表达量的结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行说明，应当理解，此处描写的实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

1、猪表皮生长因子EGF基因的获得：