[发明专利]一种布鲁氏菌融合蛋白、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种布鲁氏菌融合蛋白。

背景技术

布鲁氏菌病(brucellosis)又称地中海弛张热，是由布鲁氏菌引起的人畜共患性全身传染病。能引起人和多种动物的急性和慢急性疾病，被感染的人和动物表现为流产及不孕不育等症状。布鲁氏菌病在国内，羊为主要传染源，牧民或兽医接羔为主要传播途径。

体外诊断核心原料的开发是开发相应诊断试剂的前提，只有开发出具有高活性、高性能的抗原抗体，体外诊断试剂产品才能成为现实。因此，针对布鲁氏菌抗体和抗原开发出能够用以生产诊断试剂的原料迫在眉睫，从某种程度上说，原料的开发也必将成为降低布鲁氏菌病蔓延的首要解决问题。

发明内容

本发明提供一种布鲁氏菌融合蛋白，所述融合蛋白包括布鲁氏菌抗原和布鲁氏菌单链抗体。

进一步地，本发明所述布鲁氏菌抗原为含有主要抗原决定簇的BP26抗原，所述布鲁氏菌单链抗体为scFv。

本发明还提供了一种布鲁氏菌融合蛋白的制备方法，其制备步骤如下：

(1)查找布鲁氏菌中含有主要抗原决定簇的BP26抗原

从NCBI(美国国立生物技术信息中心)中查找到布鲁氏菌含有主要抗原决定簇的BP26 抗原。

(2)优化布鲁氏菌BP26抗原基因的密码子，合成核酸序列并进行表达

在大肠杆菌中表达蛋白时，不同密码子使用的频率有较大区别，为了使融合蛋白的表达量达到最大，需将布鲁氏菌BP26抗原基因序列进行密码子优化，然后合成优化后的核酸序列并进行表达。

(3)构建针对布鲁氏菌BP26抗原的单链抗体，调取单链抗体scFv的基因

将纯化之后的BP26抗原蛋白免疫小鼠获得高活性的单克隆抗体，再调取单链抗体scFv 的基因。

(4)重组优化的布鲁氏菌BP26抗原基因和针对布鲁氏菌BP26抗原的单链抗体scFv基因，并进行表达

将优化后的布鲁氏菌BP26抗原基因(11-250aa)和针对布鲁氏菌BP26抗原的单链抗体 scFv基因(能够针对结合BP26抗原蛋白的3-10aa部分)通过递归PCR技术连接起来，测序分析序列正确后，把融合蛋白的基因片段插入到表达载体上进行表达。

(5)纯化及复性布鲁氏菌融合蛋白。

本发明的表达系统为大肠杆菌表达系统，它具有周期短，费用低，表达量大等特点。

为了使得融合蛋白更好地保持活性位点，本发明选择比较温和的培养和诱导条件，其表达时的诱导温度为20℃、25℃、28℃、37℃，进一步优选的诱导温度为25℃、37℃，更进一步优选的诱导温度为25℃。诱导转速为250rpm，诱导的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷) 浓度为0.1mM。这样使得融合蛋白有了更加缓慢的表达，有充分的时间进行空间构象的形成。

本发明可以采用超声的方式破碎细菌。在破碎菌体的时候，为了避免剧烈条件，将破碎条件定为200w，每次超声6s，间隔3s超声一次，共180次。

本发明融合蛋白的纯化方式有离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析等方法，进一步优选为亲和层析。

本发明在融合蛋白中加入了6XHis标签，使亲和层析纯化方式能够达到较高的纯度。

本发明的融合蛋白利用基因工程重组技术，在大肠杆菌系统中表达布鲁氏菌抗原和单链抗体的融合蛋白方法，具有生产周期短、产量高、成本低等优点。

本发明的布鲁氏菌融合蛋白可做为布鲁氏菌免疫诊断试剂盒的一部分。

本发明具有以下优点及有益效果：

(1)首次开发针对布鲁氏菌主要抗原BP26的单链抗体scFv。

本发明在开发单克隆抗体的基础上又进行重组抗体技术开发单链抗体，单链抗体具有以下优点：1)具有完整的抗原结合位点，不含抗体恒定区；2)分子量小，减少了抗体的非特异性结合，降低了诊断产品的假阳性风险；3)结构简单，易于基因工程改造；4)易于在细胞中表达，可以在真核或者原核细胞中表达，可大量生产，成本较低。

(2)国内外首次开发布鲁氏菌主要抗原表位及针对BP26抗原的scFv融合蛋白。