[发明专利]梨PbrmiR397a及其应用

说明书

本发明公开了梨PbrmiR397a及其应用。一种分离自‘砀山酥梨’具有调控梨果实石细胞发育的microRNA基因(PbrmiR397a)，其前体核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。通过农杆菌介导遗传转化方法将PbrmiR397a转化烟草，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PbrmiR397a基因具有减少木质素合成的功能。PbrmiR397a基因的发现，为减少木质素合成的分子育种提供新的基因资源。由于PbrmiR397a基因具有同时靶向调控多个基因的优点，为分子育种提供更高效地途径。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及梨PbrmiR397a及其应用，具体涉及从‘砀山酥梨’中分离、克隆得到一个调控梨果实石细胞发育的microRNA基因(PbrmiR397a)及其应用。

背景技术

中国每年的梨产量占到了全球产量的60％以上。但由于果实品质较差，梨的出口量只占全世界梨出口量的15％左右，而且出口价格明显低于平均出口价格。梨石细胞含量是影响梨果实品质的重要因素之一。梨果实石细胞是由薄壁细胞在其细胞壁上沉积了大量木质素而形成的厚壁细胞。因此木质素的合成是影响石细胞发育的关键因素[1]。

木质素的含量与组成在不同植物、组织、细胞和亚细胞位置差异很大，且受发育阶段和环境的影响[2]。双子叶植物中主要是G-木质素和S-木质素，并有微量的H-木质素；单子叶植物中G-木质素和S-木质素含量差不多，并含有比双子叶植物多的H-木质素。通常G-木质素和 S-木质素的含量要比H-木质素多。木质素不易进行化学降解，其含量直接影响作物转化为生物燃料和纤维质产物的能力[3]。

木质素的研究已在多种植物中广泛开展，包括模式植物拟南芥、林木植物(杨树、桉树)、作物(玉米、苜蓿、水稻、柳枝稷、甘蔗)以及少量的果蔬(竹笋、枇杷)等，但不同植物的木质素相关研究目的不尽相同。拟南芥作为模式植物，主要用于开展一些基础研究；桉树等林木植物作为造纸原料，柳枝稷、甘蔗等作为生物能源植物，木质素含量是制约其产物转化的重要因素，因此，研究目标在于获得积累较少木质素的植株或是形成更容易被化学方法降解的木质素[4]。

MicroRNAs(MiRNAs)是近年来备受关注的一类非编码RNA，它在生物中广泛存在，长度为19-25nt。在植物中，由具有茎环结构的miRNA前体经过DCL1(Dicer-like1)酶的两步切割产生成熟miRNA。成熟miRNA与Argonaute蛋白结合进入RNA诱导沉默复合体 (RNA-induced silencing complex,RISC)，通过碱基互补配对的方式与靶基因的mRNA结合导致靶基因的表达被抑制，其作用机制主要包括引起靶基因mRNA降解和抑制翻译两种情况。miRNA在生物体的不同发育阶段和不同部位，存在着时间上和空间上的特异表达，对生物体的转录后基因调控起着关键作用[5]。随着园艺植物miRNAs研究的不断深入，越来越多的证据表明miRNA在园艺植物生长发育，以及响应生物胁迫与非生物胁迫方面都起着重要的调节作用。

有关miRNAs调控木质素的研究最早出现在Acacia mangium上。通过对Acaciamangium 高木质素含量(41％)和低木质素含量(21％)次生木质部的两个样品进行高通量测序，得到了两个miRNAs数据库。经过比较发现这些miRNAs预测的靶基因为一些转录因子，而这些转录因子在木质素的合成过程中，起着重要的作用[6]。随后又发现在Acaciamangium中，有 6个高度保守的miRNAs家族参与次生细胞壁的合成。其中miR 166家族在韧皮部和木质部中表达量上存在着巨大的差异。MiR 166家族的miRNAs预测的靶基因(HD-ZIPIII、C4H、CAD、 CCoAOMT)在木质素的合成过程中，担任着重要的角色[7]。在木本植物的模式植物毛果杨 (Populus trichocarpa)中，miR 397的靶向基因为49个漆酶基因。MiR 397过量表达的转基因毛果杨中，漆酶基因的表达量全部下调，而且与野生型相比茎干中木质素含量下降40％[8]。