[发明专利]一种葛仙米藻胆蛋白的提取、纯化方法及纯化的藻红蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效提取及纯化葛仙米藻红蛋白的方法和纯化的藻红蛋白。

背景技术

葛仙米(Nostoc sphaeroids Kutzing)，学名拟球状念珠藻，属蓝藻门(Nostocaceae)念珠藻属(Nostoc.)，与发菜同属，古称天仙米、天仙菜，又名水木耳、田木耳、地木耳(Nostoc commune vauch)，是我国传统出口的珍贵药食两用固氮蓝藻。它是一种多细胞的丝状植物，其细胞结构简单、个体由圆球形细胞组成不分枝的单列丝状体，丝状体呈念珠状，群体呈胶质状、球状或其他不规则形状，蓝绿色或黄褐色，肉眼可见，具有固氮能力。《本草纲目》、《药性考》、《全国中草药汇编》等称葛仙米的功效为明目益气、令人有子、解热清隔、利肠胃、痰火能疗、久食延年、消除疲劳、收敛、治夜盲症、烫火伤等。

藻胆蛋白是广泛存在于红藻、蓝绿藻和隐藻的藻胆体(Phycobilisomes，PBS)中的捕光色素蛋白，包括藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)、藻红蛋白(Phycoerythrim，PE)、藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanin，PEC)和别藻胆蛋白(Allphycocyanin，APC)四类。葛仙米藻胆蛋白含量丰富，优于其他藻类。藻红蛋白是一类附加值非常高的荧光色素蛋白，可用于免疫分析中可溶性抗原、抗体检测诊断试剂、荧光探针、荧光标记等。目前市面上1mg纯度在95％以上的藻红蛋白售价达到5000元以上，纯度越高售价剧增。

藻胆蛋白的纯化通常首先需要经过如盐析法、等电点法或结晶法等初步分离除去杂蛋白后，再通过柱层析法纯化，包括羟基石灰石吸附层析法、纤维素系列离子交换层析法、亲和层析和分子排阻层析法。

在藻胆蛋白粗提粉中，杂蛋白含量极高。要分离得到商品应用标准的藻红蛋白，用已报道的藻胆蛋白分离纯化方法，操作复杂，导致生产成本太高，无法大量制备以满足潜在的市场需求。因此，有必要开发一种简单有效的适合大量制备分离纯化藻红蛋白的方法，为实现葛仙米藻红蛋白的工业化生产提供技术基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效提取及纯化葛仙米藻红蛋白的方法和纯化的藻红蛋白。

为实现上述目的，本发明提供了一种葛仙米藻胆蛋白的提取方法，包括以下步骤：(a)将葛仙米干粉加入水中；(b)加入液氮，不断搅拌，待液氮挥发完全；(c)离心过滤，得到葛仙米藻胆蛋白提取液；(d)冷冻干燥得到葛仙米藻胆蛋白粗提粉末。

步骤(a)中，所述水可以是纯水、去离子水、蒸馏水等。

步骤(a)中，所述葛仙米干粉和水的质量比为1:40～1:70；优选地，为1:50，或1:60。

步骤(b)中，所述液氮的加入量为葛仙米干粉和水总质量的0.5％～1％。

步骤(b)中，所述搅拌的时间为4h-10h；优选地，为6h。

步骤(c)中，所述离心的转速为5000rpm-8000rpm；离心的时间为20min-30min；可以采用碟式离心机离心过滤。

本发明还提供了一种葛仙米藻红蛋白的纯化方法，包括以下步骤：(1)选用阴离子交换柱过柱；(2)配置PB缓冲液Buffer A和PB-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；(3)葛仙米藻胆蛋白粗提粉末用PB缓冲液Buffer A溶解，离心，过滤；(4)洗泵，用PB缓冲液Buffer A平衡离子交换柱；(5)将步骤(3)制备的溶解于PB缓冲液Buffer A中的葛仙米藻胆蛋白直接上样，PB-NaCl缓冲液Buffer B梯度洗脱，收集洗脱液；(6)用盐溶液清洗离子交换柱，然后用碱溶液溶液反向冲洗；(7)对步骤(5)的洗脱液进行超滤浓缩，透析，得到纯化的葛仙米藻红蛋白水溶液；(8)步骤(7)得到的葛仙米藻红蛋白水溶液0～10℃保存。

步骤(1)中，所述过柱前先用去离子水置换阴离子交换柱中的20％的乙醇水，其目的是阴离子交换柱用20％的乙醇水保存，使用前应该将其置换掉。