[发明专利]一种细胞培养方法

说明书

本发明属于细胞培养领域，尤其涉及一种细胞培养方法。本发明提供了一种细胞培养方法，包括如下步骤：1)分离外周血单个核细胞；2)将步骤1)的分离外周血单个核细胞添加到含有血浆和活化培养基中活化NK细胞；3)将增殖培养基添加到步骤2)中培养至第10天的外周血单个核细胞中促进NK细胞的增殖。本发明提供的细胞培养方法能有效解决体外扩增NK细胞时存在的扩增细胞量少的技术缺陷。

技术领域

本发明属于细胞培养领域，尤其涉及一种细胞培养方法。

背景技术

细胞免疫治疗是一种新兴的肿瘤治疗模式，是依靠自身免疫抗癌的新型治疗方法。它从病人体内采集免疫细胞，然后进行体外培养和扩增，再回输到病人体内，来激发以及增强机体的自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。与手术、放疗及化疗对免疫损伤不同，细胞治疗能大大提高患者的抗癌免疫力，清除手术治疗不能触及的血液、淋巴或转移到其它组织中的癌细胞、甚至是休眠的癌细胞，相比之下治疗更加彻底。

NK细胞即自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗风湿、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。其它几个具有抗癌功能的细胞包括杀伤性T细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)。由于巨噬细胞内含有很多炎症因子，目前还无法用于细胞治疗。DC是一类免疫调节细胞，主要作用是抗原加工并呈递给T细胞，再靠T细胞发挥抗癌作用。T细胞的抗癌作用需要再次激发才有效，只有经DC活化后才能起作用T细胞初次遇到抗原时并无杀伤作用，而只是形成免疫记忆，只有再次遇到抗原后，才能激发出强有力的杀伤功能。现在很多人用的CIK中主要是经细胞因子活化的T细胞。其实，未经DC抗原呈递、单独靠细胞因子活化的杀伤T细胞的疗效是非常有限的。与CIK和DC相比，NK除了释放细胞因子杀伤肿瘤细胞外，还可以通过抗体介导的细胞毒效应(ADCC)和释放穿孔素来杀伤细胞，具有更强的肿瘤杀伤能力。然而，与CIK相比，目前用NK细胞治疗的相对较少，其主要原因是NK细胞的制备较难。

目前，制备人NK细胞的方法主要有两种。一是采用磁珠分离法，直接从PBMC中分离NK细胞。但由于NK细胞在PBMC中的比例很少，所得NK细胞的数目不多，只适用于小规模制备NK细胞及分析性研究。二是体外扩增法，用PBMC或者已经分离的NK细胞，通过一些特殊细胞因子的刺激，使NK细胞在体外扩增。但是，至今大多体外扩增技术只能使NK细胞扩增几十倍，且纯度低、活性差、成本高，难以满足临床使用需求。

因此，研发一种能促进NK细胞大量增殖的培养方法是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明公开的一种细胞培养方法能有效解决体外扩增NK细胞时存在的扩增细胞量少的技术缺陷。

本发明公开了一种细胞培养方法。包括如下步骤：

1)分离外周血单个核细胞；

2)将步骤1)的分离外周血单个核细胞添加到含有血浆的活化培养基中培养至第10天，含有血浆的活化培养基激活外周血单个核细胞活化；所述活化培养基包括：抗CD16单克隆抗体、IL-2、抗坏血酸、TGF-β1、胸腺肽和无血清基础培养基；

3)将增殖培养基添加到步骤2)中培养至第10天的外周血单个核细胞和含有血浆的活化培养基中继续对所述外周血单个核细胞培养直至回收细胞，所述增殖培养基包括：IL-1α、IL-2、抗坏血酸、IL-21、IL-7、4-1BBL和无血清基础培养基。

其中，所述活化培养基对外周血单个核细胞的NK细胞进行活化。

其中，所述增殖培养基促进外周血单个核细胞的NK细胞快速增殖。