[发明专利]一种间充质干细胞因子组合物及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种间充质干细胞因子冻干粉，其特征在于，至少含有纤连蛋白15.0～25.0ng/g、血管内皮细胞生长因子0.45～4.5ng/g、纤维芽细胞生长因子 0.85～8.5ng/g、上皮细胞生长因子1.0～4.5ng/g、肝细胞生长因子15.0～25.0ng/g和转化生长因子7.5～17.5ng/g；所述冻干粉的制备方法，包括以下步骤：1)收集哺乳动物的间充质干细胞得到间充质干细胞单细胞悬液，并将收集到的间充质干细胞接种到培养液中进行细胞培养，具体包括：a.制备DMEM/F12培养液，其中培养液中含体积分数为15％胎牛血清、100～200U/mL青霉素和100～200U/mL链霉素；b.将收集得到的间充质干细胞单细胞悬液置37℃，体积分数为5％CO₂培养箱中培养，细胞达80％～90％融合后传代，收集第4代细胞作为培养细胞；c.选取培养细胞中处于对数生长期的细胞，接种于12孔板，加入步骤a制备的DMEM/F12培养液培养24～72h，收集上清液，微孔滤膜过滤，即得间充质干细胞培养液，于-20～-30℃保存；2)对培养完成的培养液进行处理，将培养得到的培养液放置于离心管中，加入硫酸铵后进行搅拌，再将搅拌液离心，去上清液后收集沉淀，向沉淀中加入浓度为0.9％生理盐水并装入透析袋，透析袋外溶液为浓度为0.9％生理盐水，进行透析，取出透析后的溶液，得到处理后的间充质干细胞培养液；3)将处理后的培养液冻干成粉末状，所述的冻干方法包括：a.加入冻干保护剂，并调节pH值为6.5；所述冻干保护剂每100ml中含有如下组分：抗坏血酸0.3～0.5g，人白蛋白0.2～0.5ml，右旋糖苷2.5～3.0g，海藻糖2g，甘氨酸0.02～0.04g，精氨酸0.05～0.15g，叔丁醇10～20ml；b.然后进行冻干：冻干压强为10～30pa，温度为-25～-30℃，时间为10～12h，即得。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞因子冻干粉，其特征在于，至少含有纤连蛋白10.0ng/g、血管内皮细胞生长因子2.5ng/g、纤维芽细胞生长因子4.0ng/g、上皮细胞生长因子2.5ng/g、肝细胞生长因子17.5ng/g和转化生长因子11.5ng/g。

3.一种制备权利要求1-2任意一项所述间充质干细胞因子冻干粉的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)收集哺乳动物的间充质干细胞得到间充质干细胞单细胞悬液，并将收集到的间充质干细胞接种到培养液中进行细胞培养，具体包括：a.制备DMEM/F12培养液，其中培养液中含体积分数为15％胎牛血清、100～200U/mL青霉素和100～200U/mL链霉素；b.将收集得到的间充质干细胞单细胞悬液置37℃，体积分数为5％CO₂培养箱中培养，细胞达80％～90％融合后传代，收集第4代细胞作为培养细胞；c.选取培养细胞中处于对数生长期的细胞，接种于12孔板，加入步骤a制备的DMEM/F12培养液培养24～72h，收集上清液，微孔滤膜过滤，即得间充质干细胞培养液，于-20～-30℃保存；2)对培养完成的培养液进行处理，将培养得到的培养液放置于离心管中，加入硫酸铵后进行搅拌，再将搅拌液离心，去上清液后收集沉淀，向沉淀中加入浓度为0.9％生理盐水并装入透析袋，透析袋外溶液为浓度为0.9％生理盐水，进行透析，取出透析后的溶液，得到处理后的间充质干细胞培养液；3)将处理后的培养液冻干成粉末状，所述的冻干方法包括：a.加入冻干保护剂，并调节pH值为6.5；所述冻干保护剂每100ml中含有如下组分：抗坏血酸0.3～0.5g，人白蛋白0.2～0.5ml，右旋糖苷2.5～3.0g，海藻糖2g，甘氨酸0.02～0.04g，精氨酸0.05～0.15g，叔丁醇10～20ml；b.然后进行冻干：冻干压强为10～30pa，温度为-25～-30℃，时间为10～12h，即得。

4.根据权利要求3所述的制备间充质干细胞因子冻干粉的方法，其特征在于，其中，步骤1)中所述的间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或肌肉间充质干细胞。