[发明专利]靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的抑制肿瘤转移的单克隆抗体及其筛选方法

说明书

本发明涉及一种靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的抑制肿瘤转移的单克隆抗体，所述的单克隆抗体为特异性结合血小板膜蛋白GPIbα的单克隆抗体。本发明还涉及一种用于筛选靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的肿瘤转移抑制剂的方法，分为五部分：第一部分是利用酶联免疫吸附测定建立的初步筛选模型，第二部分是利用免疫印迹法建立的二次筛选模型，第三、四、五部分是利用流式细胞仪及连续光谱荧光仪建立的功能检测模型。本发明中建立的筛选模型可显著减少在获得靶向血小板膜糖蛋白GPIbα抑制剂过程中对人源血小板的需求，并最大程度在体外实验中活化肿瘤细胞，模拟了肿瘤细胞微环境，提高了筛选准确性，所获得的抗体YQ3具有很好地临床应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及药理学，具体是指一种靶向血小板膜糖蛋白GPIbα的抑制肿瘤转移的单克隆抗体及其筛选方法。

背景技术

血小板能够促进肿瘤转移，其促进肿瘤转移的第一步及关键点是肿瘤细胞激活血小板形成瘤栓。血小板表面的多种粘附分子例如糖蛋白(Glycoprotein,GP)Ib-IX-V、GPIIb-IIIa等相互作用从而介导肿瘤细胞与血小板的粘附。其中GPIbα是GPIb-IX-V复合物中最大也是最重要的组成部分。有研究表明，敲除GPIbα基因或替换GPIbα胞外区的小鼠模型可显著减少小鼠肺癌的肺部转移，但会并发血小板减少症(Jain S,Zuka M,Liu J,etal.Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(21))。另有研究表明，抗GPIIb/IIIa单克隆抗体可以有效阻断血小板与肿瘤细胞的粘附和聚集，但存在潜在的出血并发症也限制了这类单克隆抗体的应用(Amirkhosravi A,Mousa SA,Amaya M,et al.Thromb Haemost,2003,90(3):549-554))。因此，确立以GPIbα为靶点，筛选出靶向GPIbα抑制肿瘤转移而不影响血小板数量及功能的抗体药物，可能为肿瘤转移带来新的治疗方法。

靶向血小板膜蛋白肿瘤转移抑制剂的筛选模型是利用药理学实验技术：酶联免疫吸附测定(ELISA)，流式细胞术(FCM)等，建立筛选模型，以筛选出抑制肿瘤转移而不影响血小板数量和功能的靶向血小板膜蛋白肿瘤转移抑制剂。在对靶向血小板膜蛋白肿瘤转移抑制剂的研究过程中至关重要。

在以往的的研究中，已有部分模型建立并应用，但大部分模型是应用于已明确其肿瘤转移抑制功能的抑制剂的功能检测，并不适用于在抑制剂筛选过程中的应用。例如：在靶向血小板膜糖蛋白GPIbα胞外区抗体A11(Zhang W,Dang S,Hong T,et al.Journal ofThrombosisHaemostasis,2012,120(14))的研究中，利用荧光标记肿瘤细胞建立检测模型来检测抗体作用下对血小板与肿瘤细胞粘附的影响。然而此模型未建立肿瘤细胞的乏氧-复氧模型来激活肿瘤细胞，模拟肿瘤细胞微环境，无法真实的模拟血小板与肿瘤细胞在体内的粘附情况。另外，此模型是应用于已确定抑制作用的抑制剂的功能检测，未能应用于待确定抑制作用抑制剂的筛选，需要进行优化，以建立筛选模型。另外，在靶向血小板膜糖蛋白GPIbα胞外区抗体5G6(Liang X,Russell S R,Estelle S,et al.Journal ofThrombosisHaemostasis,2013,11(10))的研究中，已经利用ELISA建立了筛选模型以筛选特异性结合GPIbα的抑制剂。然而此模型只适用于可以获得大量人源血小板从而可以制备出纯化GPIbα的前提下，针对目前国内的研究环境，大量人源血小板难以获得，从而无法得到纯化的血小板膜蛋白，因此此模型需要改进。

建立靶向血小板膜蛋白GPIbα肿瘤转移抑制剂的筛选模型，可以在抑制剂的研发过程中，将无效样品及早发现去除，增加研发效率，减少研发工作量。为了更好地建立筛选模型，更准确的模拟血小板与肿瘤细胞作用微环境，以更方便精准的筛选出抑制剂，需要对现有模型进行优化，克服其需要大量人源血小板，以及无法准确模拟肿瘤微环境等缺点。另外需要从初步筛选，二次筛选，到功能验证，建立一系列完整的筛选模型，使筛选过程更加系统规范。

发明内容