[发明专利]支气管原代上皮细胞的培养与鉴定方法

权利要求书

1.支气管原代上皮细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、用胶原蛋白铺满器皿的表面，包被处理后备用；

S2、经支气管镜，用一次性气管刷取支气管前壁上皮细胞，用一次性吸液管吹吸离心管内毛刷数次后，加入培养基内，点到包被好的培养皿中间培养至细胞铺满整个细胞孔；

S3、用胰蛋白酶－EDTA消化液消化细胞孔，转移到细胞培养瓶细胞培养箱培养，1-2天换液一次，至细胞铺满整个细胞瓶。

2.如权利要求1所述的支气管原代上皮细胞的培养方法，其特征在于，步骤S1的详细过程为：用无菌0.006-0.008mol/L乙酸将胶原蛋白稀释到0.03-0.05mg/mL，在12孔板内每孔加300-400uL，确保胶原蛋白溶液铺满器皿的表面，开盖在超净台中常温放置1-2小时后，用保护性毛刷洗3-5次后，在超净台中利用风机吹干并用紫外消毒30-40min后使用。

3.如权利要求2所述的支气管原代上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述胶原蛋白为鼠尾胶原蛋白。

4.如权利要求1所述的支气管原代上皮细胞的培养方法，其特征在于，步骤S2的详细过程为：经支气管镜，用一次性气管刷取支气管前壁上皮细胞，力道均匀刷3-4次后，用无菌剪刀剪下前端毛刷，放入装有RPMI1640培养液的离心管内；用一次性吸液管吹吸离心管内毛刷数次后，1000-1200rpm离心10-15分钟，去上清后加入150-170uL BEGM培养基，吸取30-50uL点到包被好的细胞培养皿中央，放到细胞培养箱培养4小时；取出以后加入500-600uL培养基，放细胞培养箱中培养，1-2天换液一次，至细胞铺满整个细胞孔。

5.如权利要求4所述的支气管原代上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述细胞培养箱培养条件为37℃、5％CO₂。

6.如权利要求1所述的支气管原代上皮细胞的培养方法，其特征在于，步骤S3的详细过程为：用胰蛋白酶－EDTA消化液消化细胞孔5-10min，加入1mLRPMI1640培养液终止消化后，1500-1700rpm离心5-10分钟，去上清后加入1mLBEGM培养基，1600-1800rpm离心5-10分钟，去上清后加入4mLBEGM培养基，转移到25cm²细胞培养瓶，放置细胞培养箱培养，1-2天换液一次，至细胞铺满整个细胞瓶。

7.如权利要求6所述的支气管原代上皮细胞的培养方法，其特征在于，胰蛋白酶－EDTA消化液的质量分数为0.25％。

8.支气管原代上皮细胞的鉴定方法，其特征在于，包括细胞免疫组化染色鉴定方法。

9.如权利要求8所述的支气管原代上皮细胞的鉴定方法，其特征在于，具体步骤为：

兔抗人的角蛋白8单克隆抗体标记支气管上皮细胞：将爬片用无水乙醇洗三次，每次浸泡5min，然后取出爬片，自然晾干，把消化好的支气管上皮细胞离心、计数以后，取5万个细胞，接种于爬片上进行培养，定期光镜下观察，待爬片长满细胞以后，爬片制作完成→4％多聚甲醛固定20min→PBS洗5min*3次→5％牛血清白蛋白室温孵育1小时→PBS洗5min、3次→1:20稀释一抗，取30ul，将爬片正面向下贴合一抗，放于湿盒中4℃冰箱孵育一整夜→PBS洗5min、3次→加入检测试剂山羊抗兔IgG/HRP聚合物15min→PBS洗5min、3次→DAPI染色7min→PBS洗5min、3次→90％甘油封片→倒置相差显微镜下观察。