[发明专利]支气管原代上皮细胞的培养与鉴定方法在审
申请号: | 201710445036.4 | 申请日: | 2017-06-12 |
公开(公告)号: | CN107236700A | 公开(公告)日: | 2017-10-10 |
发明(设计)人: | 吴卫东;李海斌;刘影影;谢冬;安珍;李文;曾样 | 申请(专利权)人: | 新乡医学院 |
主分类号: | C12N5/071 | 分类号: | C12N5/071;G01N33/577;G01N33/569 |
代理公司: | 北京酷爱智慧知识产权代理有限公司11514 | 代理人: | 孟凡臣 |
地址: | 453003 河南省新乡*** | 国省代码: | 河南;41 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 支气管 上皮细胞 培养 鉴定 方法 | ||
1.支气管原代上皮细胞的培养方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、用胶原蛋白铺满器皿的表面,包被处理后备用;
S2、经支气管镜,用一次性气管刷取支气管前壁上皮细胞,用一次性吸液管吹吸离心管内毛刷数次后,加入培养基内,点到包被好的培养皿中间培养至细胞铺满整个细胞孔;
S3、用胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞孔,转移到细胞培养瓶细胞培养箱培养,1-2天换液一次,至细胞铺满整个细胞瓶。
2.如权利要求1所述的支气管原代上皮细胞的培养方法,其特征在于,步骤S1的详细过程为:用无菌0.006-0.008mol/L乙酸将胶原蛋白稀释到0.03-0.05mg/mL,在12孔板内每孔加300-400uL,确保胶原蛋白溶液铺满器皿的表面,开盖在超净台中常温放置1-2小时后,用保护性毛刷洗3-5次后,在超净台中利用风机吹干并用紫外消毒30-40min后使用。
3.如权利要求2所述的支气管原代上皮细胞的培养方法,其特征在于,所述胶原蛋白为鼠尾胶原蛋白。
4.如权利要求1所述的支气管原代上皮细胞的培养方法,其特征在于,步骤S2的详细过程为:经支气管镜,用一次性气管刷取支气管前壁上皮细胞,力道均匀刷3-4次后,用无菌剪刀剪下前端毛刷,放入装有RPMI1640培养液的离心管内;用一次性吸液管吹吸离心管内毛刷数次后,1000-1200rpm离心10-15分钟,去上清后加入150-170uL BEGM培养基,吸取30-50uL点到包被好的细胞培养皿中央,放到细胞培养箱培养4小时;取出以后加入500-600uL培养基,放细胞培养箱中培养,1-2天换液一次,至细胞铺满整个细胞孔。
5.如权利要求4所述的支气管原代上皮细胞的培养方法,其特征在于,所述细胞培养箱培养条件为37℃、5%CO2。
6.如权利要求1所述的支气管原代上皮细胞的培养方法,其特征在于,步骤S3的详细过程为:用胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞孔5-10min,加入1mLRPMI1640培养液终止消化后,1500-1700rpm离心5-10分钟,去上清后加入1mLBEGM培养基,1600-1800rpm离心5-10分钟,去上清后加入4mLBEGM培养基,转移到25cm2细胞培养瓶,放置细胞培养箱培养,1-2天换液一次,至细胞铺满整个细胞瓶。
7.如权利要求6所述的支气管原代上皮细胞的培养方法,其特征在于,胰蛋白酶-EDTA消化液的质量分数为0.25%。
8.支气管原代上皮细胞的鉴定方法,其特征在于,包括细胞免疫组化染色鉴定方法。
9.如权利要求8所述的支气管原代上皮细胞的鉴定方法,其特征在于,具体步骤为:
兔抗人的角蛋白8单克隆抗体标记支气管上皮细胞:将爬片用无水乙醇洗三次,每次浸泡5min,然后取出爬片,自然晾干,把消化好的支气管上皮细胞离心、计数以后,取5万个细胞,接种于爬片上进行培养,定期光镜下观察,待爬片长满细胞以后,爬片制作完成→4%多聚甲醛固定20min→PBS洗5min*3次→5%牛血清白蛋白室温孵育1小时→PBS洗5min、3次→1:20稀释一抗,取30ul,将爬片正面向下贴合一抗,放于湿盒中4℃冰箱孵育一整夜→PBS洗5min、3次→加入检测试剂山羊抗兔IgG/HRP聚合物15min→PBS洗5min、3次→DAPI染色7min→PBS洗5min、3次→90%甘油封片→倒置相差显微镜下观察。
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