[发明专利]CRISPR/SaCas9特异性敲除人CXCR4基因的方法

权利要求书

1.用于特异性靶向人CXCR4基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID NO:1～4所示序列中的任意一条序列。

2.根据权利要求1所述的用于特异性靶向人CXCR4基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

3.CRISPR/SaCas9特异性敲除人CXCR4基因的方法，该方法用于非诊断和治疗目的，其特征在于，步骤包括：

1)在权利要求1或2所述的sgRNA的靶序列的5’端加上用于形成粘性末端的序列，得到正向寡核苷酸；在权利要求1或2所述的sgRNA的靶序列的互补链的两端加上用于形成粘性末端的序列，得到反向寡核苷酸；合成所述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，变性、退火，形成带有粘性末端的双链sgRNA寡聚核苷酸；

2)线性化腺相关病毒载体AAV-CRISPR/SaCas9，将所述双链sgRNA寡聚核苷酸连入线性化的AAV-CRISPR/SaCas9载体，转化感受态细胞，筛选获得阳性克隆，摇菌，抽提质粒；

3)将步骤2)提取的含有所述双链sgRNA寡聚核苷酸的AAV-CRISPR/SaCas9载体包装成腺相关病毒；

4)用步骤3)包装的腺相关病毒感染目的细胞，培养，收集被感染的目的细胞，进行酶切检测和克隆测序，确定CXCR4基因的敲除效率，并获得基因敲除的细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)，在所述靶序列的5’端加上CACCG得到正向寡核苷酸；在所述靶序列的互补链的5’端加上AAAC，3’端加上C，得到反向寡核苷酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述正向寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:5所示，所述反向寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:6所示。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述正向寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:7所示，所述反向寡核苷酸的序列SEQ ID NO:8所示。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)，所述双链sgRNA寡聚核苷酸带有BsaI酶切位点；步骤2)，用BsaI核酸内切酶切割AAV-CRISPR/SaCas9载体，使所述载体线性化。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)，所述感受态细胞为DH5α感受态细胞；步骤4)，所述目的细胞为HEK-293T细胞，所述酶切检测为T7E1酶切检测，所述克隆测序为TA克隆测序。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤4)，T7E1酶切检测中使用的PCR扩增引物对的序列如SEQ ID NO:13～14所示。

10.特异性敲除人CXCR4基因的CRISPR/SaCas9系统，其特征在于，所述CRISPR/SaCas9系统包含有权利要求1或2所述的特异性靶向人CXCR4基因的sgRNA。