[发明专利]一种用于紫斑牡丹与中原牡丹的分子鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种用于紫斑牡丹与中原牡丹的分子鉴定方法。

背景技术

紫斑牡丹[Peaonia rockii(S.G.Haw et L.A.Lauener)T.Hong et J.J.Li]属毛茛科，芍药属，牡丹组，花瓣基部具紫色斑，为著名的观赏花卉，栽培种植集中分布于甘肃兰州市、临夏和临洮等地区，栽培优良品种约2000余种，由于紫斑牡丹传统品种是经过野生种引种驯化，之后通过与中原牡丹杂交形而形成的，而目前的新的栽培种是与中原牡丹再次回交得到的，因此其种源复杂，不同地区各自命名，常有同名异物、同物异名现象，在种苗生产、营销和推广上存在混乱、互代、以假充真等问题，影响地方产业信誉。随着紫斑牡丹的推广种植和新品种培育，未来品种资源队伍庞大，将涉及知识产权的纷争。紫斑牡丹与中原牡丹长期杂交的结果，亲缘关系复杂，形态多样，品种间区别较小，且牡丹同品种及同植株具有受环境影响形态变化丰富。利用传统的形态学、组织学特征进行鉴定非常困难，这给紫斑牡丹品种知识产权保护和鉴定带来了困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于紫斑牡丹与中原牡丹的分子鉴定方法，应用该方法来鉴定紫斑牡丹，具有快速、准确等特点，适合推广应用。

其具体技术方案为：

一种用于紫斑牡丹与中原牡丹的分子鉴定方法，包括以下步骤：

(1)对待鉴定样品进行DNA提取；

(2)PCR扩增

以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别用matK序列的正向和反向引物进行扩增，P1(5’-CCTATATCCGCTACTCCTTC-3’)和P2(5’-CTCAGTGAATTTCACCACG-3’)，分别得到扩增产物；

(3)序列校正、比对

将来自GeneBank的紫斑牡丹matK序列(AF033592.1)与所有扩增后的样品序列，经过人工校正、对齐并除去引物区及测序质量较差区域的片段，最终获得干净、长度一致的序列进行比对；

(4)序列分析

利用MEGA(5.05)分析序列间的变异位点。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明通过实验研究发现，紫斑牡丹的matK序列在第31bp和79bp两个位点处与所有中原牡丹序列发生差异，是最保守的2个差异位点，故这两个位点可作为鉴定紫斑牡丹和中原牡丹的信息位点。基于以上发现，本发明提供了matK序列作为DNA条形码在鉴定紫斑牡丹中的应用。

本发明能够在传统分类学的基础上，通过提取DNA、PCR扩增技术及序列分析比对，即可将紫斑牡丹和中原牡丹品种有效进行区分，由于牡丹遗传背景的复杂性，利用matK分子标记的方法可以避免传统分类学中出现的误差，可以更加快捷有效得为国内牡丹市场及品种的繁育带来理论和实践的基础。

附图说明

图1紫斑牡丹与中原牡丹matK序列第31bp差异位点图；

图2紫斑牡丹与中原牡丹matK序列第79bp差异位点图；

图3基于紫斑牡丹和中原牡丹部分栽培品种matK序列和最大简约法(MP)构建的系统发育树图。

具体实施方式

下面结合具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例

用甘肃不同地区的4份紫斑牡丹野生种材料、42份紫斑牡丹栽培种及来自洛阳的11份中原牡丹种质为试材，用TIANGEN公司DNA提取试剂盒提取样本DNA，采用的正向引物：CCTATATCCGCTACTCCTTC，反向引物CTCAGTGAATTTCACCACG，PCR扩增条件为95℃预变性5min，接下来95℃30s，48℃退火45s，72℃延伸30s，共进行35次循环，最后72℃延伸7min,获得的产物经测序后比对，在31bp(碱基T)和79bp(碱基C)处为紫斑牡丹与中原牡丹鉴定的2个固定差异位点。

如图1、图2、图3所示，图1、图2中，1-20表示紫斑牡丹品种，21-24为中原牡丹品种，S为来自Genebank的紫斑牡丹matK序列。将所有紫斑牡丹和中原牡丹品种的序列进行比对分析后，可得到两个固定的差异位点，从这两个位点可以清晰的将紫斑牡丹和中原牡丹品种区分开来。接着构建了所有样品的MP最大简约树，从进化树中可以看出，中原牡丹各个品种首先聚为一起，它们之间的亲缘关系较近，而紫斑牡丹品种与中原牡丹品种不在一个进化枝内，且亲缘关系较远，因此，从系统发育树可以将紫斑牡丹和中原牡丹有效分开。