[发明专利]用于BRAFV600E基因突变的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，尤其涉及的是用于BRAF V600E基因突变的试剂盒及检测方法。

背景技术

目前，肺癌己成为全球癌症死亡的首要原因，全球每年新发病例150万，严重威胁人类健康。在肺癌患者中，非小细胞肺癌约(NSCLC)占80％，且就诊时80％己失去手术或放射治疗最佳机会，致使其长期生存率低，疗效令人堪忧。IIIB/IV期非小细胞肺癌2年生存率仅10％-20％，中位生存时间仅10-12月。因此，人们需要不断研究新的治疗方法以提高肺癌治疗的有效率，其中以分子靶向治疗为代表的新治疗方法，为晚期NSCLC的治疗带来了新的希望。

甲状腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。2010年甲状腺癌的发病率均居所有女性恶性肿瘤的前十位。随着人们生活方式、饮食结构的改变，平均寿命的提高，甲状腺癌的发病率可能还将进一步上升。在常规健康体验中，有很多人会被查出甲状腺结节，“良性还是恶性？”是大家最关心的问题。目前，B超引导下穿刺涂片检查是鉴别结节良恶性的主要手段。但受多种因素的影响，不少结节依靠穿刺涂片检查仍无法定性。

有一种叫做BRAF的原癌基因，该基因的突变与多种肿瘤的发生有关，最常见于甲状腺乳头状癌和皮肤黑色素瘤。乳头状癌约占所有甲状腺癌的85％以上。发现并鉴定BRAF突变是近年来甲状腺癌研究领域的重大进展。一般认为，与没有BRAF突变的甲状腺癌相比，检出BRAF突变的甲状腺癌恶性程度更高，转移和复发的风险也更大。

突变扩增阻滞系统(amplification refraCtory mutation system，ARMS)也叫等位基因特异性PCR，该法是在PCR基础上发展而成的，是一种直接用于点突变分析的PCR技术。其依据的基本原理是Taq DNA聚合酶缺少3′到5′外切酶活性，因此对于3′末端错配的引物以低于正常末端配对引物的速度延伸，当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时，扩增反应终止。

BRAF基因是EGFR信号传导通路重要成员，参与和调控细胞的增值分化和增长全过程。大部分肿瘤的突变都是体细胞突变，突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起。因此所提取的DNA常带有大量野生型DNA，所以对体细胞突变检测需要较高的特异性，而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限，不能完全满足临床需要。特异性探针法如以Scorpions ARMS为代表的英国DxS和中国厦门Adx的BRAF V600E检测试剂盒虽然检测灵敏度高，但其检测费用较高，不适合国内NSCLC患者的常规检测和筛查，因此，临床迫切需要开发一种快速准确、操作简便、灵敏度高的检测BRAF V600E基因突变的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的检测BRAF V600E基因突变的试剂盒成本过高的不足，提供了一种用于BRAF V600E基因突变的试剂盒，本发明的另一目的在于，提供一种用于BRAF V600E基因突变的检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

用于BRAF V600E基因突变的试剂盒，其特征在于：包括BRAF V600E基因突变检测的特异引物和探针，其特异引物与探针包括如下序列：

优选的，所述的探针5’端FAM荧光素，3’端标记MGB猝灭荧光素。

优选的，所述的试剂盒还包括BRAF V600E突变及BRAF野生型PCR反应液、酶系1、阳性对照、阴性对照和DEPC水。

优选的，还应包括可用于血清游离DNA样本、组织样本或穿刺样本的BRAF V600E基因突变的检测。

作为优选，还应包括如下扩增体系：

一种BRAF V600E基因突变的检测方法，所述的方法包含以下步骤：

(1)样本DNA的提取

血清游离DNA提取：推荐使用Sigma公司的GenEluteTMPlasma/Serum Cell-Free Circulating DNA Purification Midi Kit。

组织样本DNA提取：推荐使用QIAgene公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(货号：56404)

(2)PCR反应体系的配制

在试剂配制室按照试剂盒说明书要求进行配制，PCR反应液16ul，酶系1

2ul、引物探针混合液2ul，模板DNA5ul，阴性对照和质控视为样本，作相同处理。

(3)结果判读：