[发明专利]一种H7N9禽流感病毒奥司他韦敏感或耐药基因型的检测试剂盒及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一组检测H7N9禽流感病毒奥司他韦耐药性突变基因型的方法及其应用。

(二)背景技术

流感(流行性感冒)是由流感病毒引起的一种人、禽、畜共患的急性传染病，其发病率、死亡率和造成的经济损失位居各传染病之首。以往感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高。以前已经报道的人感染H7亚型的禽流感病毒的有H7N2、H7N3和H7N7，引起人的呼吸道感染和结膜炎等症状，在荷兰、美国、英国等国家共造成100多例感染，其中1例死亡。2013年3月，我国上海、江苏、安徽、浙江等地出现人感染H7N9禽流感病例，这是全球首次发现人感染H7N9禽流感，是由来自于H9N2内部蛋白基因、H7血凝素基因和N9神经氨酸酶基因等禽源流感病毒基因片段重配形成的一个新病毒所致。自此，由H7N9禽流感病毒感染造成的疫情持续在我国发生。

目前临床上使用两类抗流感病毒的药物，一类是干扰病毒M2蛋白功能的药物，即金刚烷胺类药物。金刚烷胺类药物用于预防和治疗A型流感病毒感染，但随着多年使用已经产生大量耐药，A型流感病毒中M蛋白普遍存在的S31N耐药突变已使金刚烷胺类失去临床价值。另一类是神经氨酸酶抑制剂(neuraminidase inhibitor,NAI)。与M2通道阻滞剂不同，神经氨酸酶抑制剂可以同时控制A型和B型流感病毒感染。目前批准使用的神经氨酸酶抑制剂主要有扎那米韦(Zanamivir)和奥司他韦(Oseltamivir)。扎那米韦的口服生物利用度太低，必需经吸入途径给药而直接到达呼吸道感染部位，因此在应用上受到很大限制。另一种唾液酸类似物奥司他韦可以通过口服发挥作用。奥司他韦(商品名：达菲，Tamiflu)是一种强效的高选择性的流感病毒NA抑制剂。奥司他韦能够竞争性地与流感病毒神经氨酸酶的活动位点结合，抑制病毒的神经氨酸酶而阻止流感病毒侵犯呼吸道细胞，干扰病毒从被感染的宿主细胞中释放。奥司他韦的使用应注意要尽早足量使用，对有发热、明显流感样症状及有接触患者或禽类史者等疑似患者，即使尚未确诊，也应及时使用奥司他韦进行治疗。除了应用于流感的治疗以外，在流行季节还可用于有可疑暴露人员和易感人群的流感预防。迄今也有少数发达国家批准了其它针对神经氨酸酶的药物，但应用非常少。然而，N9亚型流感病毒中第294位由精氨酸突变为赖氨酸(R294K)能使病毒株对奥司他韦表现出了强烈的耐药性。

目前建立了多种利用分子生物学方法检测具有奥司他韦耐药性基因型流感病毒的方法，如单核苷酸多态性分析、滚环扩增技术、Sanger测序、二代测序、数字PCR等，但这些方法不仅费时、费力、比较昂贵，而且还会由于实验室、工作人员、操作方法和标本的不同而影响其敏感性和特异性。耐药表型的检测需要在生物安全3级实验室(BSL-3)进行病毒分离和神经氨酸酶活性实验，其实验周期至少一周以上，费时费力，费用昂贵，而且检测难度很高，生物安全风险大。

大多数患者感染来源是农贸市场，因此需要对农贸市场等外环境进行持续监测。此外，对已经确诊的人感染H7N9禽流感患者进行持续的耐药基因型监测也缺乏相应的快速便捷的方法。目前，区分H7N9禽流感病毒奥司他韦敏感或耐药基因型尚没有商品化的试剂盒，然而监测病毒耐药突变情况、监测禽类来源和外环境H7N9禽流感病毒耐药突变情况均有重要意义。

(三)发明内容

本发明建立H7N9禽流感病毒奥司他韦敏感或耐药基因型鉴别方法，检测成本低廉，可大幅度节省检测费用。所建立的H7N9亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR方法具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉，一次试验即可完成H7N9亚型禽流感病毒敏感和/或耐药基因型的分型等优点。是N9亚型禽流感病毒奥司他韦敏感或耐药基因型快速筛选与及确认的良好方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种H7N9禽流感病毒奥司他韦敏感或耐药基因型(即R294K突变基因型)的检测试剂盒，所述试剂盒包括RT-PCR或PCR扩增反应液和阳性对照，所述RT-PCR或PCR扩增反应液包括特异性扩增引物和荧光探针，所述特异性扩增引物和荧光探针序列如下；

所述特异性扩增引物序列如下：

R294K-F：5’TGACTGGAACTGCTAAGCATATTGA3’；

R294K-R：5’TGTCATTGCTACTGGRTCTATCTGA3’；

所述荧光探针序列如下：

K294-Pb1：5’FAM-CACATGCAAGGACA-MGB-NFQ3’；