[发明专利]一种新型酵母诱导型启动子及其应用

权利要求书

1.一种酵母诱导型启动子在调控酵母基因表达中的应用：所述酵母为酿酒酵母，诱导物为氰胺；所述酵母诱导型启动子为序列表中序列1所示的DNA序列；该启动子长度为673bp。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酵母诱导型启动子的制备过程为：

（一）酿酒酵母的基因组DNA提取：

①、收集5ml酵母细胞，在16000g、15s条件下离心后弃上清，加230ul DNA裂解液重悬菌体；

②、加入0.4g小玻璃珠，和200ul苯酚/氯仿/异戊醇的混合溶液，涡旋3min;其中，苯酚、氯仿和异戊醇的质量份数比为25:24:1；

③、在16000g、5min条件下离心后将水层转移到一个新的EP管中；

④、加600ul冰乙醇洗剂DNA,然后将EP管放在-20℃中30min;

⑤、在4℃、16000g、15min条件下离心收集DNA，弃乙醇，在空气中干燥3min;

⑥、用200ul TE重悬DNA,加5ul RNA酶后37℃孵育10min;

⑦、加5M NaCl 8ul和两倍体积的冰乙醇，在-20℃放置30min；在16000g、15min的条件下离心后弃乙醇，放在空气中干燥；

⑧、用水/TE重悬DNA,得到酵母基因组DNA；

（二）用高保真Phusion酶PCR扩增得到DDI2启动子：

PCR 体系的总体积 50 μl，其中Phusion 0.5 μl，Phusion Buffer 10 μl，dNTP Mix 2μl，模板 100 ng，上游引物浓度 10 μM、1 μl，下游引物浓度 10 μM、1 μl，H₂O补足到50 μl；prc反应条件为： 98℃、1min条件下进行预变，然后98℃、10s，55℃、30s，72℃、40s，如此进行30个循环，然后在72℃、10min进行扩增，扩增得到DDI2启动子。

3.根据权利要求 2所述的应用，其特征在于，所述引物对的序列如下 ：

U1: 5’-TCTAAGATAAAACACAGATCGAC-3’

U2: 5’-GATTGATTCTTTTGAAGAGAAGC-3’。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述诱导物氰胺的浓度为5-8mM。