[发明专利]一种TGF‑β1修饰脐带间充质干细胞的制备方法及在类风湿疾病的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物与新医药技术领域，更具体的说，是一种TGF-β1修饰脐带间充质干细胞的制备方法及在类风湿疾病的应用。

背景技术

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性全身性自身免疫性疾病。它是以全身关节炎症改变为主的疼痛性疾病。可侵犯全身各处关节，呈多发性和对称性慢性增生性滑膜炎，由此引起关节软骨和关节囊的破坏，最后导致关节强直畸形。免疫系统的主要功能是甄别外来物质并将之清除，在细胞免疫中，巨噬细胞识别外来组织，细胞或抗原等物质，经处理后传递给T细胞，T细胞激活后产生细胞因子，并聚集其他炎症细胞(包括其他T细胞和巨噬细胞)产生更多细胞因子，大量巨噬细胞被激活并且释放了白细胞介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子(TNF)，致使软骨细胞和滑膜细胞释出细胞毒素，造成关节及其周围正常细胞和组织伤害，滑膜增生，骨和软骨受损。T细胞还可激活体液免疫中的B细胞，使之产生抗体，联合补体在炎症部位吸引多形核白细胞，后者释放细胞因子和自由氧残基造成细胞损害。

转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。TGF-β1、β2和β3功能相似，一般来说，TGF-β对间充质起源的细胞起刺激作用，而对上皮或神经外胚层来源的细胞起抑制作用。TGF-β1具有抑制免疫活性细胞的增殖、抑制淋巴细胞的分化和调节细胞表型等作用。关键是TGF-β1可以抑制细胞因子的产生，如抑制PBMC中IFN-γ和TNF-α的产生。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。本研究采用的是脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。也可以用于治疗类风湿关节炎和心脑血管疾病、骨和肌肉衰退性疾病。

发明内容

本发明提供了一种TGF-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)修饰脐带间充质干细胞的技术，以及所述间充质干细胞用于治疗类风湿疾病的药物的用途。具体包括：

(1)TGF-β1基因

本发明中委托北京博迈德基因技术有限公司合成TGF-β1基因，并连接到pUC57克隆载体上，进行扩增测序，表1中的引物用于PCR扩增。

表1 TGF-β1引物表

(2)重组病毒表达载体

本发明中使用的载体是慢病毒载体pLent-C-GFP，pLent-C-GFP表达基因载体含有一个原始复制子(origin of replication)，一个巨细胞病毒的启动子序列(CMV)，和限制性内切酶位点(NotI，AsiSI等)，选择性的抗性基因(抗氨苄青霉素)及标签蛋白(绿色荧光蛋白)。通过NotI和AsiSI双酶切后的TGF-β1基因，即目标DNA，在T4连接酶作用下，与载体DNA连接，形成表达TGF-β1的完整载体pLent-TGF-β1(见图1)。

(3)宿主细胞

本发明所用的宿主细胞为脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)。MSC是属于中胚层的一类多能干细胞，主要来源于结缔组织。本实验中主要是从脐带中获取，成为脐带间充质干细胞。MSC具有以下优势：(1)MSC具有增值速度快和多向分化潜能；(2)MSC具有具有免疫调节功能；(3)多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性；(4)面目模糊，表面抗原不明显，异体移植排异较轻，配型要求不严格。

(4)经TGF-β1修饰后脐带间充质干细胞的应用途径及剂量

本发明中包含TGF-β1修饰后脐带间充质干细胞，所用间充质干细胞的数量为0.5×10⁶～1×10⁸/Kg。通常所用的间充质干细胞的剂量为0.5×10⁶-1.0×10⁷/kg。