[发明专利]一种杆状病毒表达系统中杆状病毒的灭活方法

说明书

本发明公开一种杆状病毒表达系统中杆状病毒的灭活方法，包括在杆状病毒表达系统表达的含有目的产物的收获液中加入灭活剂的步骤；所述灭活剂由去污剂和有机溶剂组成，其中所述去污剂占所述收获液和灭活剂的总体积的0.5‑5％，所述有机溶剂占所述收获液和灭活剂的总体积的0.15‑1.5％，优选所述去污剂与所述有机溶剂二者的体积比为1:0.3。本发明的方法能对杆状病毒表达系统中的杆状病毒进行有效灭活，同时又能保持杆状病毒表达系统生产出的AAV病毒和重组蛋白的活性，为杆状病毒表达系统生产的AAV和重组蛋白的安全性提供新的保障。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种杆状病毒表达系统中杆状病毒的灭活方法。

背景技术

杆状病毒(Baculovirus)是一类在自然界中仅感染节肢动物的病毒。虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)、家蚕核多角体病毒(BmNPV)等。其中研究最深入的是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nuclearpolyhedrosis virus，AcMNPV)，它是双链超螺旋大分子环状DNA，其大小为90～160kb，约编码154个基因能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体^[1]。

自1983年Smith等首次报道用昆虫杆状病毒生产系统成功表达人β-干扰素以来^[2]，由于该系统的安全性好、表达产量高、易放大生产和低成本等独特的优点，越来越受到研究者的青睐。迄今，重组杆状病毒表达系统已经得到了非常广泛的应用。其中运用较多的领域主要包括生产疫苗、腺相关病毒(AAV)载体生产和重组蛋白等^[3]。到2016年，利用该系统生产的9个药物已经被FDA或EMA批准上市，其中包括5个兽用疫苗和4个人用疫苗或人用治疗药物，见表1^[3]。随着技术的成熟，昆虫细胞杆状病毒生产系统的运用将会越来越广泛。

重组腺相关病毒(rAAV)载体在基因治疗中表现出良好的应用前景。但是重组AAV病毒载体的规模化生产一直是该载体运用于临床的一个瓶颈。2002年Urabe利用杆状病毒生产出有活性的rAAV载体^[4]，将rAAV的生产带入一个新的发展阶段。2012年被欧洲批准的第一基因治疗药物Glybera，用于治疗家族性脂蛋白脂肪酶缺乏症，就是采用的杆状病毒生产系统生产的重组AAV^[5]。

杆状病毒表达系统生产重组AAV和重组蛋白主要包括两个步骤，第一步是昆虫细胞的培养，第二步是利用重组的杆状病毒感染昆虫细胞，杆状病毒在感染昆虫细胞过程中控制AAV的生产和重组蛋白的表达。所以在此表达系统中伴随着有活性的杆状病毒的存在。

根据CFDA/FDA的要求，为了提高生物制品的安全性，除了在原辅材料方面控制质量外，在生物制品制备过程中需要采取合适的方法对产品以外的病毒进行灭活或去除处理^[6]。

目前国内外较为成熟的病毒灭活或去除方法主要有物理法和化学法两大类。物理法包括加热、巴氏灭活、光照等方式，但是多数生物制品在此条件下不稳定，应避免采用；柱层析和过滤方法有很好的去除病毒作用，但存在使用范围有限的缺陷，如纳米膜过滤仅适用于分子量较小(直径较小)的蛋白，且价格昂贵。化学法主要有有机溶剂/去污剂(S/D)、辛酸钠、低pH等灭活方式。低pH法仅适用于对酸不敏感的样品，一般需要较长的灭活时间；辛酸钠法是新发展的病毒灭活方法，具有安全、快速和高效的特点，但是有些生产系统并不适用；有机溶剂/去污剂(S/D)法最早用于血液制品的病毒灭活，但存在着处理时间较长(4-6h)的缺点。

针对杆状病毒表达系统，重组AAV和重组蛋白生物制品中，最终的产品不能包含有活性的杆状病毒，所以杆状病毒表达系统生产重组AAV或重组蛋白产品等，需要在下游的纯化过程中，采取合适的病毒灭活方法对杆状病毒进行灭活同时需要保持目的产物活性。