[发明专利]一种高效诱导泥鳅同源四倍体鱼苗的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程育种技术领域，具体公开了一种高效诱导泥鳅同源四倍体鱼苗的方法。

背景技术

同源四倍体，是指体细胞中含有四套相同来源染色体组的个体，通常是由二倍体生物染色体加倍产生。人工诱导鱼类同源四倍体在水产动物育种研究中具有重要的意义，一方面，能育的人工四倍体鱼与普通二倍体鱼交配，可得到大量的可供养殖生产的三倍体后代，解决了人工诱导三倍体在生产规模上的局限性、诱导效率不稳定和胚胎死亡率高等问题，是规模化生产三倍体鱼的最佳方法；另一方面，人工合成的同源四倍体，由于确切的知道其起源祖先，并且，与二倍体相比，DNA序列没有差异，实现了倍性系列的配套，可以准确地反应多倍体形成早期基因变化与基因组变异特点，为研究生物进化过程中染色体组复制的作用及基因的表达方式提供了良好的模式系统。因此，同源四倍体鱼的诱导一直是染色体组工程育种中备受关注的问题。

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)以其丰富的营养价值和特有的滋补药用功效而被誉为“水中人参”，深受中国、日本及韩国等地消费者的青睐。近年来，泥鳅的市场需求量日益增加，市场价格节节攀升，泥鳅养殖已经成为水产养殖者的新宠，泥鳅新品种的培育对泥鳅产业的发展具有重要的意义。泥鳅四倍体在自然界中早已存在，但有研究发现，这些天然四倍体泥鳅是由二倍体泥鳅祖先通过种间杂交产生，并且已经发生了二倍化，因此，真正具有遗传功能的同源四倍体泥鳅只能通过人工诱导获得。

关于泥鳅同源四倍体的诱导，目前尚未见文献报道，但在其近缘种大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)中，Nam等(2001)曾有过报道，他们采用热休克法诱导出了少量的四倍体个体，随后常重杰&杜启艳(2002)采用同样的方法也获得了部分四倍体个体。然而，在实际操作中，研究人员发现，由于胚胎个体间发育速度不同，同源四倍体鱼的诱导诱导条件(如，处理起始时间、休克温度和处理持续时间等)难以掌握，四倍体的出现率和存活率非常低下(常重杰&杜启艳，2002)，并且诱导效果不稳定、结果的可重复性很差。迄今为止，同源四倍体的人工诱导仅在虹鳟中获得成功并应用于生产，在泥鳅等其它鱼类中尚未获得两性能育并形成群体的四倍体鱼，这严重阻碍了泥鳅等鱼类新品种的开发。

本发明中，我们开辟了一种新的、高效诱导同源四倍体泥鳅的方法，使用该方法诱导同源四倍体泥鳅，诱导效率远高于目前的诱导方法，并且效果稳定、结果的可重复性强，在泥鳅多倍体育种、以及与多倍化相关的遗传学研究等方面有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效诱导泥鳅同源四倍体鱼苗的方法，本方法简便易行，可诱导出批量的同源四倍体鱼苗，诱导效率较传统的方法有显著的提高，并且诱导结果稳定。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种高效诱导泥鳅同源四倍体鱼苗发方法，包括下述步骤：将野生二倍体泥鳅的卵子与精子按常规方式授精后，将受精卵置于40.5±0.5℃水浴中热休克处理2-3min，随后迅速转移至1.5±0.5℃冰水中冷休克处理30-60min，受精卵复温，然后继续孵化至出苗。

以上所述的方案中，优选的，按照下述步骤进行：

25℃条件下，将野生二倍体泥鳅的卵子与精子授精，28min后，将受精卵置于40.5℃水浴中热休克处理2min，随后迅速转移至1.5℃冰水中冷休克处理45min，受精卵复温，然后继续孵化至出苗。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供的诱导泥鳅同源四倍体泥鳅的方法，操作简便、方法高效。利用本发明所述方法，同源四倍体泥鳅鱼苗的产率可达10.4±0.3％，远高于目前的诱导方法，并且效果稳定、可重复性强。本发明为同源四倍体泥鳅苗种的生产提供了高效的技术手段，在泥鳅多倍体育种、以及与多倍化相关的遗传学研究等方面具有重要的应用价值。

附图说明

图1为不同诱导方法下泥鳅鱼苗的早期存活率、四倍体泥鳅的出现率和四倍体泥鳅的产率。

热休克(40.5℃)指的是：25℃下，将野生二倍体泥鳅的卵子与精子授精28min后，将受精卵置于40.5℃水浴中，分别热休克处理1min、2min和3min，共3组实验；

冷休克(1.5℃)指得是：25℃下，将野生二倍体泥鳅的卵子与精子授精28min后，将受精卵置于1.5℃水浴中，分别冷休克处理30min、45min和60min，共3组实验；