[发明专利]一种原代猪肝细胞的分离及培养方法

说明书

本发明提供了一种原代猪肝细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：(1)选取3~4周龄，体重2.5~4 kg的雄性中国实验小型猪，术前12 h禁食禁水，腹腔注射戊巴比妥钠和肝素；(2)将实验猪麻醉后腹面向上固定于板上，无菌条件下切开腹腔；(3)静脉插管，用恒流泵灌注预热的HBSS缓冲液；(4)用恒流泵灌注预热的GBSS混合酶溶液；(5)剪碎组织用GBSS混合酶液振荡消化，筛网过滤，离心，弃上清；(6)取细胞滤液用锥虫蓝染色检测细胞活性；(7)细胞计数后用完全培养基重悬接种到包被后的培养瓶，置于37℃、5%CO₂环境中培养；(8)细胞形态鉴定；(9)ELISA法检测；(10)RT‑PCR检测。本发明提供的一种猪肝细胞的分离及培养方法，操作简单，所得细胞数量多，成活率高，是一种理想的原代猪肝细胞分离与培养方法，为实验提供可靠的细胞资源。

技术领域

本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域，具体涉及一种原代猪肝细胞的分离及培养方法。

背景技术

肝细胞承担者正常肝脏大部分主要而复杂的功能，包括调节糖、脂肪、蛋白三大物质的生物合成，具有对内源性和外源性异常物质的解毒代谢功能，在维持正常肝脏功能中起着关键作用。猪肝细胞在生理和代谢功能与人肝细胞最为接近，同时半透隔膜和转基因猪的产生，能有效减轻免疫反应，使猪肝细胞成为生物人工肝(BAL)研究应用最多的肝细胞。

肝细胞作为细胞移植治疗慢性肝衰竭的种子细胞以及作为药物筛选的靶细胞，制备和培养大规模的、高活力的肝细胞是这些研究的最基本环节。因此肝细胞的分离和培养技术正日益受到人们关注，成为当前研究的热点。

目前肝细胞的分离方法有机械分离法、螯合法和酶消化法等。机械法操作简单，但分离获得的肝细胞数量少、活性差。Howard创建了胶原酶灌流法，Seglen进一步将这种方法发展为两步灌流法。胶原酶灌流法 得到的肝细胞数量和活性都得到提高，灌流法广泛应用于大鼠、小鼠、犬和兔等动物。

本发明在传统分离方法的基础上采用改进的两步灌流法，旨在提供一种操作简单、高效的获得生长状态好、纯度高的原代猪肝细胞的方法，建立一套完善可靠的原代猪肝细胞体外培养技术。

发明内容

根据上述问题，本发明提供了一种猪原代肝细胞的分离及培养方法，该方法操作简单，细胞产量和成活率高，是一种较为理想的原代猪肝细胞培养方法，可以满足多种生理生化实验的要求。

一种原代猪肝细胞的分离及培养方法步骤包括：(1)选取3~4周龄，体重2.5~4 kg的雄性中国实验小型猪，术前12 h禁食禁水，腹腔注射戊巴比妥钠和肝素；(2)将实验猪麻醉后腹面向上固定于板上，无菌条件下切开腹腔；(3)静脉插管，用恒流泵灌注预热的HBSS缓冲液；(4)用恒流泵灌注预热的GBSS混合酶溶液；(5)剪碎组织用GBSS混合酶液振荡消化，筛网过滤，离心，弃上清；(6)取细胞滤液用锥虫蓝染色检测细胞活性；(7)细胞计数后用完全培养基重悬接种到包被后的培养瓶，置于37 ℃、5% CO₂环境中培养；(8)细胞形态鉴定；(9)ELISA法检测；(10)RT-PCR检测。

其中，步骤 (1) 所述的戊巴比妥钠浓度为30 mg/kg体重，肝素100 U/kg体重。

其中，步骤(3)所用的HBSS缓冲液（PH为7.2~7.4）含1%~5%的BSA以保持细胞的活性，防止酶的分解和非特异性吸附。

其中，步骤(3)所用的所用恒流泵灌注速度为25~50 ml/min，灌注时间5~20 min，灌注量800~1000 ml。

其中，步骤(4)和(5)所用GBSS混合酶液（PH为7.2~7.4）为含0.1%~0.5% Ⅳ型胶原酶和0.002%~0.006%DNase Ⅰ的溶液。

其中，步骤(4)所用恒流泵灌注速度为5~10 ml/min，灌注时间15~30 min，灌注量100~300 ml。