[发明专利]一种C‑肽免疫抗原和抗C‑肽多克隆抗体及其制备与应用

权利要求书

1.一种C-肽免疫抗原的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂的合成：将王树脂和赖氨酸混合进行偶联合成，得到8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂；

(2)树脂裂解和去保护：将步骤(1)制得的8分支MAP核心结构七聚赖氨酸树脂与裂解试剂混合，然后搅拌反应；反应后将反应液过滤，收集滤液，浓缩，浓缩物用水溶解并用乙醚萃取，得到七聚赖氨酸水溶液；

(3)七聚赖氨酸的分离与纯化：采用高效反相液相色谱仪对步骤(2)制得的七聚赖氨酸水溶液进行分离，检测280nm吸收值，收集主峰析出液，浓缩，干燥，得到七聚赖氨酸；

(4)将步骤(3)制得的七聚赖氨酸与MBS混合，搅拌反应，得到MBS活化的七聚赖氨酸；将C-肽与MBS活化的七聚赖氨酸混合，搅拌反应，得到C-肽免疫抗原粗品；

(5)在-15～-20℃盐水浴，氮气保护下，将甲基吗啡啉和氯甲酸异丁酯依次滴加到Fmoc-Cys-OH中，反应5～10min；加入乙酸酐，在-15～-20℃盐水浴，氮气保护下，继续反应1～1.5h，得到反应产物1；然后将反应产物1从盐水浴中取出，室温继续反应15～30min，得到反应产物2；在反应产物2中加入水和乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯相；在乙酸乙酯相中加入质量分数为10％的碳酸氢钠溶液进行萃取，将Fmoc-Cys-OH以及乙酸酐洗出；在乙酸乙酯相中加入水进行萃取，将残留的碳酸氢钠洗出；加入无水硫酸钠，除去乙酸乙酯相中残留水分；除去无水硫酸钠，乙酸乙酯相浓缩，加入2倍Fmoc-Cys-OH质量的硅胶，混匀，并干燥；

(6)将步骤(5)制得的产物装柱，步骤(4)制得的C-肽免疫抗原粗品溶于PBS缓冲液，然后使用中压过柱，采用PBS缓冲液为洗脱剂，收集含目标峰的流份；将得到的流份与等体积的乙醚混合，收集沉淀物；沉淀物与4-甲基-3-硝基苯胺反应，产物用PBS缓冲液洗涤；洗涤后的产物在365nm紫外光下照射30～60min，得到C-肽免疫抗原；

步骤(1)中所述的王树脂和赖基酸的摩尔比为1∶7。

2.根据权利要求1所述的C-肽免疫抗原的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的裂解试剂包含如下组分：TFA 900mL/L、苯甲硫醚50mL/L、二巯基乙烷30mL/L、苯甲醚20mL/L。

3.根据权利要求1所述的C-肽免疫抗原的制备方法，其特征在于：

步骤(5)中所述的Fmoc-Cys-OH、甲基吗啡啉和氯甲酸异丁酯的体积比为1:1:1。

4.根据权利要求1所述的C-肽免疫抗原的制备方法，其特征在于：

步骤(5)中所述的乙酸酐的用量为100mg/100μL Fmoc-Cys-OH。

5.根据权利要求1所述的C-肽免疫抗原的制备方法，其特征在于：

步骤(5)中所述的氯甲酸异丁酯的滴加速度为20～30滴/min。

6.一种C-肽免疫抗原，其特征在于通过权利要求1～5任一项所述的制备方法制备得到。

7.一种抗C-肽多克隆抗体，其特征在于利用权利要求6所述的C-肽免疫抗原制备得到。

8.权利要求7所述的抗C-肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

采用权利要求6所述的C-肽免疫抗原免疫兔子，取血，离心得到抗血清，即为抗C-肽多克隆抗体。

9.权利要求8所述的抗C-肽多克隆抗体的制备方法，其特征在于还包括纯化步骤：

将权利要求8中所述的抗血清加入25μL/mL的辛酸溶液中，混匀，然后离心，收集上清液，将滤液用10×PBS缓冲液混合，在2～4℃下缓慢加入硫酸铵，使其终浓度为40～45％w/w；离心，收集沉淀；沉淀用PBS缓冲液溶解，置于PBS缓冲液中透析然后干燥，得到C-肽多克隆抗体。

10.权利要求7所述的抗C-肽多克隆抗体在制备C-肽快速免疫检测产品中的应用。