[发明专利]痰液中醋酸镰孢氨酸C和双甲硫基胶霉毒素的高效液相色谱-串联质谱同时检测方法

说明书

本发明提供了一种痰液中醋酸镰孢氨酸C(TAFC)和双甲硫基胶霉毒素(bmGT)的高效液相色谱‑串联质谱同时检测方法，步骤如下：(1)标样和试样的制备；(2)采用液相色谱‑串联质谱法对步骤(1)所得各标样和试样进行测定，得到标样和试样谱图，记录各标样和试样谱图中TAFC、bmGT和非那西丁的峰面积；(3)绘制TAFC和bmGT的工作曲线，根据试样谱图中TAFC与非那西丁的峰面积比值、bmGT与非那西丁的峰面积比值和工作曲线计算出试样中TAFC和bmGT的浓度。本发明实现了从痰液中对TAFC和bmGT的同时检测，为TAFC和bmGT的检测提供了新的途径，有利于提高检测效率。

技术领域

本发明属于仪器分析检测领域，涉及一种痰液中醋酸镰孢氨酸C(N,N',N-triacetylfusarinine C,TAFC)和双甲硫基胶霉毒素(bis(methylthio)gliotoxin,bmGT)的高效液相色谱-串联质谱同时检测方法。

背景技术

曲霉菌是自然界中广泛存在的一种真菌，在相对温暖和湿润的环境中会较为快速的生长和繁殖。空气中弥散的真菌孢子可通过人体的呼吸进入呼吸道定植。为了深入了解曲霉菌在人群中的分布情况，国内、外研究者在不断探索呼吸道中是否有曲霉菌定植的方法。目前鉴定人体呼吸道内是否有曲霉菌定植的方法主要是痰液真菌培养，然而该方法敏感性很低而且培养周期很长。因此，目前有越来越多的研究在探索通过曲霉菌标志物的检测来判断呼吸道是否存在曲霉菌定植。

TAFC是曲霉菌在缺铁环境下合成和释放的一种铁载体。bmGT是由曲霉菌合成和分泌的另一种化合物。目前，有文献报道使用高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)从血清中检测TAFC的方法，也有研究者采用高效薄层色谱分析仪(HPTLC)从血清中检测出bmGT的方法。然而，血清的检测存在敏感性较低的弊端，基于局部器官和组织的标本检测可能会能更好地反映曲霉菌在人体中特定部位的分布情况。痰液是呼吸道分泌物，因此痰液中曲霉菌相关标志物的检测可能更直接地反映呼吸道曲霉菌的定植。此外，现有方法尚无法实现TAFC和bmGT这两种化合物的同时检测。因此，若能开发出从痰液中同时检测TAFC和bmGT的方法，对于深入研究曲霉菌在人体呼吸道的分布与定植情况、丰富TAFC和bmGT的检测途径、提高检测效率都将产生积极的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种痰液中TAFC和bmGT的高效液相色谱-串联质谱同时检测方法，以丰富TAFC和bmGT的检测途径，提高检测效率。

本发明提供的痰液中TAFC和bmGT的高效液相色谱-串联质谱同时检测方法，步骤如下：

(1)标样和试样的制备

①将TAFC和bmGT用甲醇溶解，并用乙腈稀释得到一系列TAFC和bmGT浓度梯度变化的混合标准液；配制非那西丁溶液作为内标溶液；

②取等体积的各混合标准液，向各混合标准液中分别加入等体积的空白痰液样品和等体积的内标溶液，然后混匀得到一系列混合液，分别向各混合液中加入萃取剂萃取2～3次，将萃取同一混合液得到的萃取液合并，在氮气保护下去除萃取剂，得一系列固态物质，将各固态物质分别用乙腈水溶液溶解并定容至同一体积，离心，所得一系列上清液即为标样；

③向待测痰液样品中加入内标溶液并混匀，再向所得含内标的痰液样品中加入萃取剂萃取2～3次，合并萃取液并在氮气保护下去除萃取剂，将所得固态物质用乙腈水溶液溶解，然后离心，所得上清液即为试样；

(2)标样和试样的测定

采用液相色谱-串联质谱法对步骤(1)所得各标样和试样按照以下色谱条件和质谱条件进行测定，得到标样和试样谱图，记录各标样和试样谱图中TAFC、bmGT和非那西丁的峰面积；