[发明专利]一种精确定量HIV DNA的检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明的公开了一种联合多种PCR精确定量HIV DNA的检测方法，具体地，本发明将巢式PCR、实时荧光定量PCR和Digital PCR联合应用以精确定量HIVDNA，通过三种PCR方法的结合，设计特异的针对HIV各个亚型的特异引物，达到对HIV DNA进行了精准定量和节约成本的目的。另外，本发明根据上述检测方法开发了精确定量HIV DNA的检测试剂盒，该试剂盒在临床上具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于分子检测领域，涉及一种精确定量HIV DNA的检测试剂盒，具体涉及一种联合多种PCR方法精准定量HIV DNA检测试剂盒。

背景技术

目前ART治疗可以将HIV RNA降低到检测不到的水平，由于HIV病毒储存库的存在，使得ART治疗不能停药，HIV病毒储存库主要以HIV DNA的形式存在，以HIV DNA形式存在的病毒储存库成为HIV根治的障碍。研究表明HIV DNA水平与停药后病毒反弹时间密切相关。HIV DNA水平越低，停药后病毒反弹时间越长。因此对HIV DNA的精确定量非常重要。由于HIV DNA的量非常低，对其精确定量非常困难。

目前对HIV DNA定量的PCR方法主要有实时定量PCR技术及digital PCR技术。目前所有这些技术均使用通用引物，由于HIV变异度非常高，HIV的亚型也非常多，不同亚型之间的基因差异在30％左右，不同地区流行的亚型不同，欧美主要流行的是B亚型，我国流行的主要有B’，B’C及AE重组亚型，目前实时定量PCR及digital PCR所用的通用引物一般对B亚型敏感，定量B亚型相对准确，而对我国流行的亚型尤其是AE亚型不敏感。

与实时定量PCR技术相比，digital PCR技术的优点为可以对大量的DNA模板进行定量，缺点为每次都需要芯片，价格比较昂贵。另外，巢式PCR因其在第一轮PCR产物内部用第二对引物进行扩增，在定性方面，其扩增的特异性和灵敏性都会大大提高，但由于巢式PCR引物是结合在第一次PCR产物内部进行的第二轮扩增，其无法实现精确定量。

本申请首次将实时定量PCR、digital PCR及巢式PCR的技术结合，并利用中国艾滋病流行毒株的特点，建立了巢式PCR-实时定量PCR-digital PCR相结合精准定量HIV DNA的方法。

发明内容

为了克服现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种联合多种PCR精确定量HIV DNA的检测方法，并且根据该检测方法开发了精确定量HIV DNA的检测试剂盒。由于HIV DNA在人体内量比较少，HIV变异度特别高，不同亚型之间HIV基因序列的差异非常大。而digital PCR由于需要特殊的芯片，价格比较贵。通过三种PCR方法的结合，设计特异的针对各个亚型的特异引物，达到对HIV DNA进行精准定量和节约成本的目的。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一种精确定量HIV DNA的检测方法，所述方法包括如下步骤：

(1)利用巢式PCR对样本进行特异性扩增以鉴定HIV DNA的有无；

(2)将巢式PCR阳性样本进行实时荧光定量PCR以确定HIV DNA量和亚型；

(3)将巢式PCR阳性、实时定量PCR阴性的样本进行Digital PCR定量HIV DNA拷贝数。