[发明专利]一种蝎肽及其制备方法

权利要求书

1.一种蝎肽的制备方法，其特征在于：

蝎肽的氨基酸序列为：SQE1；

第1步、经过色谱得到A和B两部分；

将冻干的蝎毒用0.01mol/L的氢氧化钠和磷酸二氢钾溶解，然后上样至凝胶离子交换色谱进行分离，收集A部分：

凝胶离子交换色谱的具体过程为，

HPLC色谱分析采用高效液相色谱仪、CXTH-3000色谱工作站，色谱柱，SephadexTMG-50200mm×250mm，

流速：5.0-10.0mL·min^-1，

检测波长：260nm，

进样量：2mL，

流动相为：

A：0.01mol/L的氢氧化钠和磷酸二氢钾，

B：0.01mol/L的氢氧化钠、磷酸二氢钾和1mol/L氯化钠，

洗脱程序：

0～10min，A；

10～35min，B；

得到峰A和峰B；

峰A的出峰时间；5-18min；

峰B的出峰时间：27-35min；

含有峰A的洗脱液为A部分；

第2步、A部分经过脱水脱盐透析袋，冷冻干燥；

A部分经过脱水，聚乙二醇，透析袋脱盐，-30℃冷冻5小时，移至冷冻干燥机，-50℃；减压干燥36小时，得到白色粉末；

第3步、白色粉末经HPLC分离纯化；

具体过程为，

HPLC色谱采用高效液相色谱仪，

色谱柱；Chromdex 75PG，10mm×300mm，5μm，

流速：0.5-2.0mL·min-1，

检测波长：260nm，

进样量：500μL，

流动相为：

A：水-0.01％三氟乙酸，

B：乙腈-水-0.01％三氟乙酸，

梯度洗脱程序：

0-5min B:5％

5-10min,B:5-20％；

10-40min；B:20-55％；

40-45min B：55-100％；

45-55min B：100％；

55-60min B：5％

收集出峰时间；44-46min的部分；

第4步、透析袋脱水脱盐，冷冻干燥；

经过脱水；聚乙二醇，脱盐，透析袋，-30℃冷冻5小时，移至冷冻干燥机，-50℃；减压干燥36小时，得到白色粉末；得到蝎毒单体；

第5步、分子量的测定；

蝎毒单体分子量的确定

样品与基质CHCA混合，用基质辅助激光解析电离-飞行时间串联质谱仪MALDI-TOF/TOF；Ultraflextreme,Brucker,Germany；在线性模式下检测；

结果显示平均分子量为6732.7686；

第6步、氨基酸序列的测定；

蝎毒单体样品经DTT还原和碘代乙酰胺烷基化处理后，加入胰蛋白酶酶解过夜；

酶解后得到的肽段再经C18ZipTip脱盐后，

与基质α-cyano-4-hydroxycinnamic acid混合点板；

用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪MALDI-TOF/TOF进行分析；

原料蝎毒的制备

将全蝎2kg，绞碎，匀浆，加入5升含5％醋酸的50％乙醇，低温5℃搅拌浸泡5次，过滤、离心过滤，取5次滤液，减压过滤，滤液通过D152型弱酸性阳离子树脂柱，以去离水洗脱，至洗脱液呈无色，然后用5％醋酸液洗脱；洗脱速度50ml/分；富集，合并、减压浓缩，浓缩物以氨水调pH8.0，低温5℃放置48小时，过滤、干澡，得白色沉淀物蝎毒。