[发明专利]一种通用型巢氏PCR检测伪狂犬病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域,具体为一种通用巢式PCR检测伪狂犬病毒方法。

技术背景

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV) 导致的一种急性高度接触性传染病。PR在不同的区域感染的比例不同，一般在养猪密集的地方流行比较严重，在多种动物均有不同程度的感染，但是猪是该病的天然宿主，感染本病后一般都会发热、奇痒，感染严重的猪会出现急性脑脊髓炎，凡是被该病感染的猪可终身带毒散毒，该病的发生给养猪业带来重大的经济损失，伪狂犬的净化是当前国内规模化猪场净化的首要任务。

伪狂犬病毒(PRV)属疱诊病毒科疱疹病毒甲亚科，暂定水痘病毒属，该病毒是一个封闭的核衣壳，属于双股DNA病毒，有囊膜，其粒子直径为50-180nm，基因组大小约为143kd，可以编码70-100种病毒蛋白,PRV感染的发生与该病毒的囊膜有着直接的关系，但是裸露的PRV同样具有感染性，但是其感染性比有囊膜病毒的感染性低。PRV中已经发现的糖蛋白有gM，gH，gE，gK，gL，gI，gC， gB，gD，gG和gN11种。糖蛋白又分为必须蛋白和非必须蛋白，在病毒增殖中必须糖蛋白有gN，gH，gK，gD，gB和gL蛋白，在病毒增殖中扮演非必须的蛋白有 gM，gE，gI，gC和gG。近年来，国内外学者建立了中和实验，乳胶凝集试验，酶联免疫吸附试验，核酸杂交，普通PCR诊断，实时荧光定量PCR检测，基因芯片等技术进行PRV的检测。其中普通PCR成本较低，操作方便，得到了广泛的应用，但是由于其灵敏度较低，PRV基因组较高的GC含量使扩增有较大的非特异性等因素使其推广应用具有一定的局限性。

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应，使用两对PCR引物扩增目的片段。经过两次PCR扩增，可以极大程度的提高普通PCR的灵敏度，且二次PCR引物发生非特异性结合的概率极低。当前伪狂犬PCR检测的靶标多为gB，但是目前gB变异较大，导致检测灵敏度降低。gH由UL22基因编码，含686个氨基酸残基，保守性很高，为PRV复制必需的一种结构蛋白，因此，编码gH糖蛋白的基因序列可作为检测PRV的诊断靶标。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种快速简便的巢式PCR检测PRV的方法，通过编码糖蛋白gH基因的保守序列，设计两对引物PRV-O-F、PRV-O-R和PRV-I-F、 PRV-I-R，进行两次PCR扩增，第一次扩增加强PCR的特异性，第二次扩增加强 PCR检测的敏感性，两轮PCR提高了PCR的敏感性和特异性。克服了普通PCR检测灵敏度低，特异性差等问题，与现有的核酸杂交，基因芯片等检测方法相比成本较低，检测周期短。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种通用型巢氏PCR检测伪狂犬病毒的方法，其特征在于：通过编码伪狂犬病毒糖蛋白gH中碱基序列得到两对检测引物，将待测样本提取DNA得到样本 DNA，将所述样本DNA用两对检测引物进行两次PCR扩增，每次PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳以检测伪狂犬病毒。

所述两对检测引物，分别为外侧引物PRV-O-F、PRV-O-R和内侧引物PRV-I-F、 PRV-I-R；所述外侧引物对应于伪狂犬病毒(PRV)糖蛋白gH中UL22基因末端与 UL21基因区间；所述内侧引物在外侧引物扩增序列内侧、且对应于伪狂犬病毒 (PRV)糖蛋白gH中UL22基因末端。

具体包括以下步骤：

1)编码得到所述外侧引物序列为：

PRV-O-F：上游引物5’-GCTCGCCCTCGTCAGCAAC-3’

PRV-O-R：下游引物5’-AACACGCGCACGCAGAGAGT-3’

编码得到所述内侧引物序列为：

PRV-I-F：上游引物5’-GCGTGTACTGCGACTGCGTGTT-3’

PRV-I-R：下游引物5’-CGACCTGGCGTTTATTAACCGAGA-3’

2)提取样品DNA

采集小猪血样，收集样本血清，用柱式血液样本DNA提取试剂盒提取DNA 得到样品DNA；

3)PCR扩增与电泳检测