[发明专利]利用等离子体诱变灵芝原生质体以构建突变菌株的方法

权利要求书

1. 一种利用等离子体诱变灵芝原生质体以构建突变菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)灵芝原生质体的构建

①灵芝液体培养菌丝体的制备；

②菌丝体匀浆制备；

③细胞壁溶解酶液的制备及细胞壁溶解；

④原生质体的分离及收集；

⑤原生质体浓度校正及保存；

(2)低温等离子体诱变原生质体

①原生质体的诱变前准备；

②等离子体诱变装置通气平衡；

③反应体系通电，对原生质体进行诱变；

④固体培养基中，原生质体平板涂布均匀和静置再生培养；

⑤诱变菌株挑选，用牙签挑选小菌落后，接种于PDA固体培养基上；

⑥观察记录菌落形态及生长速率，光镜下观察菌丝形态；

⑦诱变菌株的活性物质和稳定性检测；

⑧选取诱变后品质优良的菌株固体培养，保存菌种；

所述步骤(1)中灵芝液体培养菌丝体的制备方法为：在无菌条件下，将固体发酵灵芝种子菌丝体接种于灭菌后的PD液体培养基中，于27-29℃，150-200rpm转速摇床震荡培养，5-7d后，将菌丝体连同菌液取出，超净台中离心后用ddH₂O清洗菌丝体；

所述步骤(1)中菌丝体匀浆的制备方法为：挑取灵芝菌丝体置于灭菌后的匀浆器中，加入0.6mol/L浓度的甘露醇；匀浆器中研磨，于超净台中制备菌丝体匀浆；光镜下观察菌丝，2000-5000rpm离心4-6min获得菌丝体匀浆，保留沉淀；

所述步骤(1)中细胞壁溶解酶液的制备采用复合酶裂解法，为崩溃酶和溶壁酶混合酶裂解液，溶液浓度38-42mg/ml；所述步骤(1)中细胞壁溶解方法为：将菌丝体匀浆沉淀混合溶解于混合酶裂解液中，终浓度10-20mg/ml，30-35℃裂解1-3h；收集裂解液，加压过滤 法滤去残余未裂解菌丝，保留过滤裂解液；

所述步骤(2)中等离子体诱变装置通气平衡过程为：将介质阻挡反应探棒置于原生质体溶液表面上方，封闭反应体系，通入反应气体4-6min，气体流量1.5-2.5L/min；所述步骤(2)中反应体系通电，电压为10-15kV，诱变3-7min，对原生质体进行诱变处理。

2.根据权利要求1所述的利用等离子体诱变灵芝原生质体以构建突变菌株的方法，其特征在于，所述步骤(1)中原生质体的分离及收集方法为：用离心管收集过滤后的细胞壁裂解液，离心后弃去上清，保留沉淀；所述步骤(1)中原生质体浓度校正及保存方法为：利用0.6mol/L甘露醇溶解稀释原生质体，用血球板计数，光镜下调整原生质体浓度为1×10⁶-10⁷个/ml，4℃低温保存，用于后续诱变。

3.根据权利要求1所述的利用等离子体诱变灵芝原生质体以构建突变菌株的方法，其特征在于，所述步骤(2)中原生质体的诱变前准备过程为：无菌条件下吸取原生质体溶液200-500μl，置于φ=2cm的石英等离子体反应皿中，轻晃石英等离子体反应皿，使原生质体溶液在石英等离子体反应皿的底部涂布均匀。

4.根据权利要求1所述的利用等离子体诱变灵芝原生质体以构建突变菌株的方法，其特征在于，所述步骤(2)中原生质体平板涂布和静置再生培养方法为：收集原生质体反应溶液，吸取20μl于再生培养基中，用灭菌后的三角涂棒沾取菌液涂布于固体培养基平板上；接着，将涂布完毕后的平板封闭，倒置于25-30℃温箱静止培养5-7d。

5.根据权利要求1所述的利用等离子体诱变灵芝原生质体以构建突变菌株的方法，其特征在于，所述步骤(2)中诱变菌株挑选方法为：原生质体再生培养5-7d，平板上长出菌落后，选取其中菌落直径0.5-2mm的单菌落，用灭菌后的牙签挑取菌丝，接种于PDA固体培养基上；所述步骤(2)中诱变菌株观察过程为：将挑选分离后的菌落培养5-7d，观察记录菌落形态及生长速率，光镜下观察菌丝形态。

6.根据权利要求5所述的利用等离子体诱变灵芝原生质体以构建突变菌株的方法，其特征在于，所述步骤(2)中诱变菌株的活性物质检测过程为：将挑选分离的菌株接种于PD液体培养基中，待菌丝球长满后对菌丝中活性成分予以测定，与出发菌株活性成分及含量比较，检测诱变效果并予以记录；所述步骤(2)中诱变菌株的稳定性检测过程为：对性状优良的菌株连续培养3代，进行表观观察和活性物质检测，观察诱变菌株的稳定性。