[发明专利]一种PWS及AS的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于遗传病基因检测技术领域，涉及一种PWS及AS的快速检测方法。

背景技术

PWS/AS是两种与基因组印记相关的遗传性疾病，父源15q11-13区域基因缺陷导致Prader-Willi综合征(PWS)，其临床表现为新生儿肌张力低，发育延迟，身材矮小，下丘脑性腺发育不良等；母源15q11-13区域基因缺陷导致Angelman综合症(AS)。15q11-13区带内各复制子之间发生非平衡易位，由于这些复制子中存在对物种生存相当重要的高度保守序列，因此，15q11-13遗传物质缺失将造成发育迟缓，语言障碍等临床表现。

印记基因具有差异表达特性，这种差异常常是由父方及母方的等位基因传给子代时发生了修饰，其中较为重要的是DNA甲基化修饰。DNA甲基化修饰是一个主要的表观遗传学修饰。

诊断PWS/AS疾病的方法有几种，如高分辨率染色体分析、荧光原位杂交、多重连接探针扩增技术(MLPA)。但是上述几种方法均比较复杂，需要时间较长，检测过程缓慢，成本高，检测结果存在不确定性。文献报道方法没有临床检测需要的质控，操作标准及其他环境控制指标。

李璃、刘安等人发表了Prader-Willi和Angelman综合征的分子遗传学诊断研究，用全基因组单核苷酸多态性微阵列芯片(SNP-array)对疑似Prader-Willi综合征(PWS)和Angelman综合征(AS)患儿进行细胞分子遗传学诊断,并根据检测结果对其家系下一胎进行产前遗传学诊断。方法对3位疑似PWS和AS患儿进行常规G显带染色体核型分析；提取患者外周血DNA进行SNP-array扫描,阳性结果进行父母样本的SNP-array检测用以溯源。上述检测方法比较复杂，需要时间较长，检测过程缓慢。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种PWS及AS的快速检测方法，采用MS-PCR方法检测PWS/AS，用重亚硫酸盐处理DNA样本，可以在短时间内完成，同时还采用柱上去亚硫酸基团的方法，使得整个操作流程更为简便，同时对多处细节做了处理和调整，形成了一套完整的检测体系，设置多个质控点，是通过临床验证可靠的检测方法。MS-PCR是一种快速、高效，并且特异性和敏感性均佳的分子诊断方法，同时，检测成本较低，可诊断绝大多数的PWS/AS临床病例。

本发明提供了如下的技术方案：

一种PWS及AS的快速检测方法，包括以下步骤：

(1).采集血液、羊水或唾液中的至少一种并进行DNA提取；

(2).提取完DNA后，对其进行质量检测；

(3).DNA甲基化处理，检测DNA甲基化处理后的浓度及纯度；

(4).进行MS-PCR反应；

(5).电泳检测，结果分析。

优选的是，所述步骤(1)中采集全血采用EDTA抗凝管采集或采血卡采集。

上述任一方案优选的是，所述用EDTA抗凝管采集具体操作方法为：采集待检者外周血5mL，立即轻柔颠倒混合采血管多次，混匀后4℃放置。将EDTA抗凝管分别包装，低温运输。

上述任一方案优选的是，所述采血卡采集的具体操作方法为：采集完血液后，滴加在采血卡上，待其晾干后进行运送。

上述任一方案优选的是，所述羊水采集的具体方法为：医生按标准采集后，专用包装保存，低温运输。

上述任一方案优选的是，所述唾液采集的具体方法为：待检者按唾液试子采集要求采集唾液样本，低温运输。

上述任一方案优选的是，所述步骤(1)中DNA提取常用例包括血斑DNA提取、全血DNA提取、羊水DNA提取、唾液DNA提取中的至少一种。

上述任一方案优选的是，所述血斑DNA提取，采用QIAGEN试剂盒进行，使用试剂盒前需要先在缓冲液AW1和缓冲液AW2中加入无水乙醇。

上述任一方案优选的是，所述全血DNA提取，采用任意提取方法或提取试剂盒提取，要求是DNA质量及浓度达到实验需求。

上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中提取DNA后，使用nanodrop对所有DNA样本进行浓度、质量检测，达到既定质检标准，可进入下一步试验，质检不通过，需重新提取或纯化处理，直到质检通过。

上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中DNA甲基化处理方法包括以下步骤：

(1).将待处理的DNA样本从-20℃取出，解冻，待DNA完全解冻后，轻微震荡离心；

(2).取PCR管，加入待处理的DNA样本与CT Conversion Reagent，颠倒混匀，短暂离心；