[发明专利]一种用于检测膀胱癌RT‑qPCR试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及癌症诊断检测用的试剂盒领域，具体为一种用于检测膀胱癌的RT-qPCR试剂盒及检测方法。

背景技术

膀胱癌是人体最常见的恶性肿瘤之一，其恶性度高，侵袭性强，易复发和远处转移，给临床治疗带来很大困难。但早期发现和治疗，5年的存活率大于90％，因此早期诊断是提高膀胱癌治疗效果和患者远期生存的关键。

目前膀胱癌的诊断和术后随访主要依靠尿脱落细胞检查和膀胱镜检查。但尿脱落细胞检查的敏感性低，尤其是低级别的肿瘤，因此膀胱癌的诊断仍依赖膀胱镜检加活检，膀胱癌术后随访也主要依赖膀胱镜检查。膀胱镜检查敏感性和准确度虽然都很高，但是具有创伤性，给病人带来不少痛苦。

肿瘤标志物检测技术被认为是早期发现无症状微灶肿瘤的唯一途径，肿瘤标志物试剂盒在膀胱癌早期诊断及筛查中起到至关重要的作用。

因此，寻找膀胱癌肿瘤标志物来早期发现或诊断膀胱癌是当前膀胱癌研究中的热点。最新研究表明，尿上清中存在大量DNA或RNA标记物，因此检测尿液中DNA或RNA标记物有望为膀胱癌的诊断提供一个新方法。

虽然已经有30多种尿液标记物可用于膀胱癌的诊断，但是用于诊断膀胱癌试剂盒只有：UroVyv50(FISH方法)，NMP-22(Elisa方法)，BTA(Elisa)，ImmunoCyt(Elisa)；而且这些方法都或多或少存在敏感性不高，假阳性率和假阴性率过高的问题，无法取代膀胱镜检查。目前国际市场用于膀胱癌诊断且敏感性较高的仅有CxBladder(RNA诊断)试剂盒，该试剂盒检测尿脱落细胞中RNA标记物：CDC2，HOXA13，MDK，IGFBP5和CXCR5其敏感性达到83％，特异性达到85％，可以作为膀胱镜检查的补充。

总的来说，现有膀胱癌诊断试剂盒的灵敏性及准确性都偏低，临床意义有限，满足不了早期诊断的要求。为了提高膀胱癌的早期诊断，提高术后生存率，改善病人生存质量，有必要开发新的肿瘤标志物并进行产业化，制备一种灵敏度高、准确性强、使用方便、价格便宜且高效的膀胱癌诊断及术后监护的诊断试剂盒。

发明内容

本发明针对现有技术的不足之处，提供一种敏感性及特异性优良的用于检测膀胱癌的RT-qPCR试剂盒。

本发明另一目的是提供一种用于检测膀胱癌的RT-qPCR检测方法。

为解决上述的技术问题，本发明采用如下技术方案：一种用于检测膀胱癌的RT-qPCR试剂盒，包括检测Survivin基因的引物：

survivin正向引物：ATGGGTGCCCCGACGTTGC；

survivin反向引物：CCCTCCAAGAAGGGCCAGTC；

survivin特异性探针：CCCTTTCTCAAGGACCACC-。

一种用于检测膀胱癌的RT-qPCR检测方法,其包括的步骤如下：

(1)取30ml尿液离心(其中转速2000rpm，时间10分钟，温度4℃)，收集上清液放入另一试管；

(2)取5ml上清液加入1mlExoQuick的exosome提取液，在4℃孵化12小时，混合液离心后(转速为1500g，时间为30分钟)使得exosome沉淀在试管底，去除上液后用100ul不含RNAase(核糖核酸酶)水悬浮exosome；

(3)在exosome试管中加入700ulQiazol洗脱液，震荡后加入120ulchloroform(三氯甲烷)；离心(转速14000rpm，时间15分钟，温度4℃)后取上清，加入同体积的体积比浓度为100％酒精；把混合液放入RNA纯化柱，离心后加700ul洗涤液，离心后再用500ul洗涤液洗一次，最后加入15ul不含RNAase水，离心收集RNA的液体，取2ul测RNA的质量与数量；

(4)用一步法RT-qPCR测定survivin

正向引物：ATGGGTGCCCCGACGTTGC

反向引物：CCCTCCAAGAAGGGCCAGTC

TagMan探针：CCCTTTCTCAAGGACCACC-

PCR混合物使用为：25ul的2xMix，1ul的正向引物(10uM)，1ul的反向引物(10uM)，1ulTagMan探针(10uM)，1ul的Taq酶；

PCR反应的条件为：95℃，15分钟，95℃，2分钟后进行40个循环，95℃，15秒，60℃30秒。

与现有技术相比，本发明的具有如下有益效果：