[发明专利]一种利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法

说明书

本发明涉及一种利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，属于植物基因克隆技术领域。本发明的NSm基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。通过构建NSm基因的植物表达载体，转化农杆菌，通过和候选抗病基因共浸润本氏烟，观察本氏烟叶片是否产生过敏性坏死的性状，进而对候选抗病基因进行鉴定。该方法能迅速、高通量的进行抗病基因的鉴定，表明基于该基因开发的植物抗病基因筛选的方法具有十分重要的应用价值。

技术领域

本发明属于植物基因克隆技术领域，具体涉及一种利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法。

背景技术

番茄斑萎病毒（Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV）已对烟草、番茄、辣椒、蔬菜等作物生产构成了巨大的威胁。现有的主栽作物品种均能被番茄斑萎病毒侵染，成为番茄斑萎病毒流行、爆发的潜在威胁。由于其传播介体——蓟马具有发育历期短、个体小易隐蔽、对杀虫剂极易产生抗药性等的特点，所以现有的防治措施难以取得理想的控制效果。利用抗病基因培育抗病作物品种是最经济、最有效的手段。

以往进行抗病候选基因鉴定和筛选主要利用转基因过表达结合基因沉默技术进行鉴定。通过分子标记锁定抗病基因连锁的scaffolds或基因区段，一般都会有多个候选基因，对多个候选基因分别进行转基因过表达需要耗费较大的人力物力。因此在进行转基因过表达前，对候选抗病基因进行进一步的快速准确筛选将极大的减少抗病候选基因鉴定和筛选的工作量，提高准确性。

在经典遗传学中，基因型控制的植物抗病性常常是由来源于植物的抗病基因 R (resistance)与相应的来源于病原物的无毒基因 Avr (avirulence)互作所决定的，即“基因对基因”学说。Avr基因的克隆和鉴定不仅有助于阐明抗病植株的抗病机制，而且基于Avr基因和R基因的对应关系，更有助于R基因的鉴定和筛选，更迅速的锁定R基因。因此在R基因克隆前，进行Avr基因的克隆和鉴定，并将含有Avr的表达载体和候选抗病基因一起共浸润来进行抗病基因鉴定，比起将全部候选抗病基因进行转基因过表达，并在转基因植株上来接种病毒来更方便、快捷，可以节约大量的人力、物力和财力。同时利用Avr基因和候选抗病基因一起共浸润进行抗病基因鉴定具有操作简便，能减少人为误差，重复性好，满足实现大规模检测的特点。

目前番茄中抗TSWV的基因SW-5b已被克隆，TSWV的NSm为其对应的Avr基因。辣椒中抗TSWV的基因Tsw最近也被已被克隆基因，其对应的Avr基因是TSWV的NSs基因。但是来源于野生烟草N. alata中抗性基因RTSW还未被克隆，其对应的TSWV Avr基因也未见报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，该方法能够快速地鉴定候选抗病基因，极大的减少了候选基因验证的难度和工作量，为快速分离、克隆抗病基因奠定了基础，对烟草抗病育种、抗病基因克隆具有显著的意义。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，包括如下步骤：