[发明专利]一种重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法

说明书

本发明公开了一种重组人IL‑24蛋白(rhIL‑24)的PEG修饰方法,包括：a.构建人IL‑24的重组原核表达载体，诱导表达，得到包涵体；b.选择变性剂对所述包涵体进行变性，得到变性后的蛋白；c.确定复性条件，对所述变性后的蛋白进行复性，得到复性后的蛋白；d.在对所述复性后的蛋白添加SDS的条件下，进行凝胶过滤纯化，得到纯化后的目的蛋白；e.对所述纯化后的目的蛋白用PEG修饰剂进行定点修饰，得到终产品。该方法在制备高纯度重组人IL‑24蛋白的基础上，利用聚乙二醇进行定点修饰，在修饰蛋白的周围产生空间屏障，减少蛋白的酶解，延长了半衰期，且不影响其体外抑瘤活性，利用率增加，提高了稳定性和生物学活性。

技术领域

本发明涉及肿瘤生物治疗技术领域，特别是涉及一种重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法。

背景技术

人白细胞介素24(Interleukin 24,IL-24)是1995年哥伦比亚大学Paul Fisher教授通过消减杂交在人黑色素瘤细胞HO-1中发现的一种细胞因子，属于IL-10超家族成员。近二十年的研究表明IL-24是抗肿瘤的“明星”分子。首先，IL-24在正常组织的内源性表达具有高度的组织特异性，只在免疫系统相关组织(如脾、胸腺和外周血白细胞)和特定类型的细胞中表达；其次，IL-24具有广谱而特异的抗瘤活性，能够抑制多种肿瘤(如肺癌、乳腺癌、宫颈癌等)的体内外生长，对正常细胞几乎没有影响，与p53基因型的改变无关；同时，IL-24具有刺激机体抗肿瘤免疫反应的能力，能够诱导外周血单核细胞PBMC产生IL-6、肿瘤坏死因子(TNF-α，IFN-γ)等；而且，IL-24可以增强肿瘤细胞的放化疗敏感性，与肿瘤靶向药物(如厄洛替尼等)、化疗药物(如顺铂等)或放疗联用可产生叠加或协同的抗瘤效果；最后，IL-24在一些肿瘤组织(如黑色素瘤)的高水平表达与预后正相关，提示它可能是一个新的肿瘤预后标志物。正是因为上述这些的特点，IL-24被称为肿瘤治疗的“神奇子弹”，对IL-24进行深入研究不仅具有重要的理论意义，而且具有重大的临床应用价值。

在将IL-24应用于临床肿瘤的研究中，美国Introgen Therapeutics公司于2002年率先开发了携带IL-24基因的重组腺病毒--“INGN241”，Ⅰ期临床实验结果显示对乳腺癌、肺癌和结肠癌的治疗效果良好。与腺病毒载体相比，基因工程蛋白药物更为安全，同时还具有药理活性高、副作用小、用量少、生物活性强、疗效好等特点。当然，在蛋白质多肽类药物的临床使用过程中也存在一些问题，如易被蛋白水解酶水解、较短的循环半衰期、需要频繁注射、较短的保存有效期、易被机体快速清除和易于引起中和抗体的产生等。因此，需求一种方法可以提高其稳定性。

发明内容

重组人IL-24蛋白在哺乳动物体系中表达水平极低，但体内外的抑瘤活性高，终浓度为ng/ml，而在大肠杆菌中表达水平高，但活性较低，终浓度为ug/ml，甚至没有活性。考虑到聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)没有免疫原性，亲水性强，在水溶液中有较大的水动力学体积，与蛋白质的某些氨基酸结合后，在修饰蛋白质的周围产生空间屏障，减少蛋白的酶解，避免在机体代谢中被快速清除，同时考虑到PEG是经美国食品药品监督管理局批准的极少数能作为体内注射用药的合成聚合物之一，本发明的申请人提出一种重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，来提高大肠杆菌中表达的重组人IL-24蛋白的活性，提高稳定性，延长其半衰期。

本发明目的在于，克服大肠杆菌表达的重组人IL-24蛋白由于缺乏糖基化修饰等原因导致活性较低的缺陷。本发明在制备高纯度重组人IL-24蛋白的基础上，利用聚乙二醇对大肠杆菌表达的重组人IL-24蛋白进行定点修饰，来提高抑瘤活性，提高稳定性，延长半衰期。

本发明的一个方面，提供一种重组人IL-24蛋白的PEG修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.构建人IL-24的重组原核表达载体，诱导表达，得到包涵体；

b.选择变性剂，对所述包涵体进行变性，得到变性后的蛋白；