[发明专利]一种中温α-淀粉酶及其基因和应用

说明书

本发明属于生物工程领域，具体地，本发明涉及一种中温α‑淀粉酶及其基因和应用。本发明的中温α‑淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的中温α‑淀粉酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了包含所述中温α‑淀粉酶基因的重组载体，以及包含所述中温α‑淀粉酶基因的重组菌株。本发明运用基因工程技术构建了含有中温α‑淀粉酶基因的重组质粒，并在枯草芽孢杆菌中实现了中温α‑淀粉酶的高效表达。构建的中温α‑淀粉酶重组菌株具有较高的应用价值，具有很高的产中温α‑淀粉酶的能力，在同等发酵条件下，较野生菌酶活提高了90％。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体地，涉及基因的克隆和重组DNA技术，尤其是一种中温α-淀粉酶及其基因和应用。

背景技术

α-淀粉酶是一种能水解淀粉的内切酶，为糖苷水解酶类的第13家族。其能水解淀粉内部的α-1,4糖苷键，产生还原糖、低聚糖、麦芽糖和糊精等。α-淀粉酶来源广泛，微生物发酵，动、植物提取均可获得。目前工业上α-淀粉酶的大规模生产主要以微生物发酵进行。枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉菌、黑曲霉菌等均可用来生产α-淀粉酶。α-淀粉酶作为一种重要的工业酶制剂，应用十分广泛，例如食品，发酵，纺织，造纸业，制药业以及化学药品工业等，甚至在临床、医学、分析化学等领域都有重要应用。

用于工业生产α-淀粉酶的菌株长期以来都是人工诱变或自然突变的高产菌株。我国对于α-淀粉酶生产菌株的选育和研究做了大量工作，从1965年开始就应用解淀粉芽孢杆菌BF7658生产α-淀粉酶。高定华等利用x射线、γ射线以及激光等诱变BF7658，使酶活提高到500-600U/ml[高定华：食品与发酵工业.1986]；邬显章等利用硫酸二乙酯、5-氟尿嘧啶和亚硝基胍等诱变BF7658变异株，获得产酶达477U/ml的高产菌株[邬显章：生物工程学报.1985]。而随着生物技术的不断发展，人们开始利用基因工程来获得α-淀粉酶的高产菌株。自八十年代以来，国内外用于α-淀粉酶生产的基因工程菌相关研究进展迅速。相较于国外，虽然我国酶制剂工业快速发展，但是仍然存在一定差距。

中温α-淀粉酶是一种适用范围比较广泛的α-淀粉酶，其最适反应温度为50-70℃。目前中温α-淀粉酶市场需求量比较大，但是现有中温α-淀粉酶生产菌株的生产水平有待提高，亟待研发出中温α-淀粉酶的高效表达菌株。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种中温α-淀粉酶及其基因、工程菌(重组菌株)和制备方法。

本发明的另一目的是提供一种制备上述中温α-淀粉酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述中温α-淀粉酶及基因工程菌的应用。

本发明从解淀粉芽孢杆菌CRVAB100(Bacillus amyloliquefaciens)中分离得到一种新的中温α-淀粉酶。

本发明提供了一种中温α-淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

本发明的中温α-淀粉酶，具有良好的热稳定性以及pH稳定性。其最适温度为60℃，在50-70℃之间剩余酶活达到80％以上，甚至在80℃保温1h后仍有60％的剩余酶活；其最适pH值为6.0，在pH值5.0-6.5时，相对酶活达到将近80％。

本发明提供了编码上述中温α-淀粉酶。具体地，该基因的基因组序列如SEQ IDNO.2所示：

本发明通过PCR的方法分离克隆了所述中温α-淀粉酶的编码基因，DNA全序列分析结果表明，中温α-淀粉酶的编码基因全长1452bp。将中温α-淀粉酶的编码基因经序列比对后发现与GENBANK ACCESSION Number为AM409180的α-淀粉酶基因相似度达99％，为一新的中温α-淀粉酶。