[发明专利]一种羊源屎肠球菌间接ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体是一种羊源屎肠球菌间接ELISA检测方法。

背景技术

近几年的研究表明，肠球菌已是医院流行的主要病原体。美国医院感染监视系统(NISS)已将其列为医院感染的第二大病原菌，检出率仅次于大肠杆菌。有资料统计，在引起尿路感染的致病菌中，肠球菌感染居第2位；腹腔、盆腔感染，肠球菌居第3位；败血症，肠球菌居第3位，病死率12.6％～57％。在肠球菌所致感染中屎肠球菌的比例占到近一半。在动物方面，近年来，屎肠球菌感染动物，导致动物发病死亡的病例日益增多，并造成人畜共患，其严重性在日益增强。屎肠球菌作为重要的条件性致病菌已给人类和养殖业造成严重损失，尽管在一些肠球菌的病原学、致病机理、耐药机制、诊断等方面有大量研究，但是对屎肠球菌致病机理和耐药机制，尤其是诊断和治疗方法的研究还非常欠缺。屎肠球菌感染主要依靠实验室细菌分离、PCR分子生物学鉴定，在基层则缺乏快速有效的屎肠球菌血清学诊断方法。血清学诊断方法的缺乏，可能使得基层对屎肠球菌感染造成误诊及漏诊，从而对畜牧业生产造成不必要的损失。现有的间接血凝(IHA)检测方法(申请号或专利号：201610382656.3)特异性不高，敏感性较差。国内曾以粪肠球菌胶原蛋白黏附素 (Ace)蛋白为抗原建立了猪源粪肠球菌ELISA检测方法。屎肠球菌胶原蛋白粘附素 (adhesin of collagen from E.faecium,Acm)蛋白在屎肠球菌中也具有特异性，故本研究通过构建pET-32a-Acm表达载体，原核表达屎肠球菌Acm蛋白，以此作为抗原建立羊源(绵羊)屎肠球菌间接ELISA血清学检测方法，为屎肠球菌的临床诊断和防治提供重要技术支持。

发明内容

本发明旨在提供一种羊源屎肠球菌间接ELISA检测方法专用试剂，以达到快速简便、特异高、敏感性好的检测效果。

一种羊源屎肠球菌间接ELISA检测方法专用试剂，Acm蛋白序列为(501个氨基酸残基)： DAGRDISSNVTSLTVDPTNITDGGNIKVKFSFDEKKQNIQPGDYLWINWPSEGNIRGEGFQKEIPLMI ENKNVGTLTVRKDSAQVVFNENIKNLDSVEGWGQFEIQARNVTDTGEENTGPFTVTSGDKTATVNV TKPASGSSSSVFYYKTGDMLPEDTKHIRWFLNINNNGTYVEQPVKISDEIQSGQRLDPSTFEINQIHLG EQKVYRGEEGIQQFLQDFPGATFNFSVTDNYIEITIPKNFVNLRKIMVSYKTIIENPEQINFENHSEAWF KEFNKPAVDGESFNHTVKNISASGGVNGTVRGELKIFKYINDTEIGIPNVTFELRRADEQPIQGQSSILL TSNEQGEASIKGLQVGDYVVKEKEAPNWIDFDPLSSNELKFSINENDTEGVSLPIYNKKKVTNITATKI WNGGTTPRPSIYFKLFRASTNNWEPVPDAETKRLDNGITSVTWEDIQQYDDSGNEYTFKVQEVDQN GNDYVPSGYQKIENGLVVTNENK。

以上羊源屎肠球菌间接ELISA检测方法专用试剂制备过程包括如下步骤：

血清制备：

第一步，病原菌的扩大培养：将配制的THB液体培养基121摄氏度高压灭菌15分钟，冷却后于超净工作台内分装至200毫升的培养瓶中，每瓶中装入180ml THB培养液；然后向200毫升培养瓶中接入1毫升预先制备的病原菌菌液，将接入菌液的培养瓶放入摇床，37摄氏度、180转/分钟震荡培养12～24小时后收集菌体；

第二步，灭活：以福尔马林作为化学灭活剂，灭活前先确定福尔马林对病原菌的安全灭活浓度，具体操作时先取多支试管，分别向所有支试管内加入5毫升预先制备的病原菌菌液，取用部分试管作为对照组，其余为实验组，向实验组试管内加入一定量的福尔马林，福尔马林加入终浓度从0.1％至1.0％；将所有试管置于4摄氏度环境中放置24小时，放置结束后分别从每支试管中取出0.2毫升菌液，涂抹于THB琼脂平板上，在37摄氏度环境中培养48小时，检测各试管内细菌的存活情况，只有没有细菌生长的对应福尔马林浓度才是该病原菌的灭活安全浓度；检测结果显示，各菌的福尔马林安全灭活终浓度均为 0.6％；依照以上安全浓度，对稀释的菌液进行灭活处理；