[发明专利]粪肠球菌高密度发酵培养基及其发酵工艺

权利要求书

1.一种粪肠球菌(Enterococcus faecalis)高密度发酵工艺，主要步骤如下：

(1)配制粪肠球菌高密度发酵种子和发酵培养基

a)种子和发酵培养基组分及其含量如下：甘油30g/L、豆粕10g/L、硫酸铵2.5g/L、三水合磷酸氢二钾2.5g/L、三水合乙酸钠8g/L、二水合柠檬酸钠4g/L、七水合硫酸镁0.7g/L、一水合硫酸锰0.1g/L；

b)种子摇瓶培养基配制方法如下：称取培养基各组分，充分溶解后，用25％氨水溶液调pH至7.0，定容至所需体积，110℃灭菌30分钟；

c)发酵罐培养基配制方法如下：发酵罐中装入20g/L氢氧化钠溶液，装液量为70％，0.11-0.16Mpa灭菌1h，冷却后放液，用自来水冲洗发酵罐2次后放空发酵罐；按上述含量分别称取各组分，用蒸馏水溶解，装入发酵罐中0.14Mp灭菌30分钟；搅拌混匀，37℃，100rpm保温1h，用25％氨水溶液调pH至7.0后，0.14Mpa灭菌40分钟；待温度稳定在37℃时，校正溶氧为100％；灭菌后的培养基在37℃，50rpm，不通气条件下空培至接种前；

(2)种子液制备

d)挑取新鲜培养的粪肠球菌斜面，接种至种子摇瓶培养基中，37℃，50r/min摇瓶培养8小时作为一级摇瓶种子液；

e)在50L发酵罐中配制二级种子培养基，培养前对二级种子培养基及一级摇瓶种子液进行镜检，确保无杂菌污染；

f)接种前将50L发酵罐转速调至100rpm，并用灭菌的25％氨水调二级种子培养基pH至7.0后，按照2％的接种量将一级种子液接入50L发酵罐中；

g)发酵参数设定：发酵温度37℃；转速200rpm；通风比0.1～0.5VVM；；不控pH不补料，发酵8h结束作为二级种子液；

(3)2吨发酵罐规模条件下的高密度发酵

h)发酵前对发酵培养基及二级种子液进行镜检，确保无污染；

i)接种前将2吨发酵罐转速调至100rpm，并用灭菌的25％氨水调pH至6.8后，将二级种子液全部转接至2吨发酵罐中进行发酵；

j)发酵参数设定为：发酵温度37℃，维持溶氧25％；发酵过程中维持发酵液pH值为5.5，当pH低于设定值时，自动流加30％的碳酸钠溶液，维持在设定值，连续补加甘油800g/L和硫酸铵80g/L的料液，保持甘油浓度维持在10g/L；

k)当补加料液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值不再增加时时，终止发酵，即得粪肠球菌活菌数达8×10¹⁰CFU/mL以上的发酵液。